miRNA與AQP2在真武湯治療阿霉素腎病綜合征中的作用機理研究.pdf

1、目的:
　　腎病綜合征（Nephrotic syndrome，NS）為兒童多發(fā)難治性疾病，發(fā)病率高達2～10/100000，為僅次于急性腎小球腎炎的第二大腎臟疾病，嚴重影響人類健康。NS病理分型復(fù)雜多樣，臨床診斷及治療難度大，一線用藥主要為糖皮質(zhì)激素類免疫抑制劑，但激素治療存在復(fù)發(fā)、激素抵抗及長期用藥副作用等問題，因此，探討NS發(fā)病機制，尋找安全有效的NS治療藥物具有重要意義。
　　真武湯為《傷寒論》中溫陽利水的代表方劑，臨

2、床廣泛應(yīng)用于慢性腎病的治療，在NS治療中取得一定療效。AQP2在腎臟水鈉代謝平衡和腎小管功能中具有重要作用，為水液代謝紊亂相關(guān)疾病治療的關(guān)鍵病理基礎(chǔ)，為NS治療的關(guān)鍵作用靶點;研究發(fā)現(xiàn)miRANs在維持腎臟穩(wěn)態(tài)中具有核心調(diào)節(jié)作用，同時也是AQP2潛在的重要調(diào)節(jié)機制。本課題以AQP2及miRNA為切入點，探討AQP2及miRNAs在NS發(fā)病中的參與機制，并利用生物信息學(xué)預(yù)測手段，體外功能獲得及缺失實驗篩選NS發(fā)病中調(diào)控AQP2表達的miR

3、NA，以此探討NS發(fā)病機制及真武湯治療NS的作用機理。
　　方法:
　　1.真武湯對阿霉素NS大鼠的治療作用研究
　　采用一次性尾靜脈注射阿霉素(6.0 mg/kg)制備阿霉素NS大鼠模型，造模一周后，給予真武湯高（16.8g·kg-1·d-1）、低(8.4 g·kg-1·d-1)治療，連續(xù)給藥四周。通過測定24h尿蛋白、血清蛋白、血脂、血肌酐、血清尿素氮及腎臟病理（HE染色病理檢查，電鏡檢查）評價真武湯對NS的治療作

4、用;并測定血漿SOD，MDA水平以及腎組織炎癥因子水平，探討真武湯對NS氧化以免疫炎癥損傷的調(diào)節(jié)作用。
　　2.真武湯對阿霉素NS大鼠水腫及腎臟AQP2表達的影響
　　制備阿霉素NS大鼠模型，造模一周后給予真武湯高(16.8g·kg-1·d-1)、低(8.4g·kg-1·d-1)治療，連續(xù)給藥四周。通過檢測各組大鼠腹水重量、腎臟指數(shù)以及血液及尿液Na+、K+、Cl-含量，考察真武湯對NS大鼠水腫及電解質(zhì)的的調(diào)節(jié)作用;并檢測血

5、清(AVP)及醛固酮(ALD)水平，測定各組大鼠腎組織AQP2表達及分布情況，探討真武湯治療NS的可能作用機制。
　　3.腎病綜合征大鼠腎臟miRNA差異表達譜研宄
　　分別取正常及阿霉素NS模型大鼠腎組織，提取總RNA，純化后進行miRNA標記、雜交。應(yīng)用GenePix Pro6.0讀取芯片結(jié)果，對結(jié)果進行中值標準化，篩選差異表達的miRNA;利用生物信息學(xué)預(yù)測工具，對差異表達miRNA進行靶基因預(yù)測，GO功能富集及Pat

6、hway分析，構(gòu)建miRNA-mRNA調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)，挖掘可能性高的靶基因及調(diào)節(jié)通路，探討miRNA在NS發(fā)病中的調(diào)節(jié)作用及調(diào)節(jié)機制。
　　4.篩選真武湯治療NS中可調(diào)控AQP2表達的miRNA
　　利用生物信息學(xué)預(yù)測手段，結(jié)合miRNA芯片結(jié)果及qRT-PCR驗證，以及體外過表達或抑制miRNA活性，篩選NS中可能調(diào)控AQP2表達的miRNA;并通過熒光素報告酶實驗驗證目標miRNA與AQP2間的調(diào)控關(guān)系，MTT及流式檢測miR

7、NA對集合管細胞增殖及凋亡的影響，結(jié)合真武湯含藥血清干預(yù)實驗，評價真武湯對AQP2及miRNA的調(diào)節(jié)作用。
　　結(jié)果:
　　1.真武湯對阿霉素NS大鼠的治療作用研究
　　(1)阿霉素注射可誘導(dǎo)典型的NS模型，造模兩周后模型組蛋白尿升高較空白對照組具有統(tǒng)計學(xué)意義，真武湯治療兩周后可降低阿霉素NS大鼠蛋白尿，改善高血脂及低蛋白血癥，恢復(fù)NS大鼠腎功能;腎臟病理提示各組腎小球結(jié)構(gòu)基本正常，模型組大鼠腎小管及腎間質(zhì)存在明顯腫脹

8、，存在大量的蛋白管型及透明管型，真武湯可改善腎小管水腫，改的腎小管管型。
　　(2)真武湯具有一定的抗氧化作用作用，可減少阿霉素NS大鼠腎臟氧化損傷，增強腎臟抗氧化能力，同時對腎臟免疫炎癥具有一定的調(diào)節(jié)作用，可上調(diào)腎組織IL-4表達，下調(diào)IL-8的表達。
　　2.真武湯對阿霉素NS大鼠的電解質(zhì)及腎臟水腫的作用研究
　　(1)阿霉素誘導(dǎo)的NS大鼠有明顯水腫表現(xiàn)，表現(xiàn)為腹水增多，腎臟腫大，腎臟指數(shù)增加，且尿量較正常大鼠明顯

9、減少;真武湯治療可明顯改善腎臟水腫，具有一定利尿作用，可促進腎臟鈉排泄，而對尿液鉀離子及氯離子排泄量沒有明顯變;
　　(2)阿霉素NS大鼠血清ALD及AVP較正常對照組明顯升高，真武湯治療可降低ALD含量，對血清AVP水平上調(diào)無明顯作用;阿霉素NS大鼠腎臟AQP2表達較正常對照組明顯降低，殘存的AQP2主要分布在集合管細胞頂端質(zhì)膜，提示AQP2表達抑制，而胞內(nèi)轉(zhuǎn)運機制并未受到影響，真武湯治療可明顯提高腎臟AQP2表達，從而提高AQ

10、P2在集合管細胞頂端質(zhì)膜的分布。
　　3.腎病綜合征大鼠腎臟miRNA差異表達譜研究
　　與正常對照組相比，阿霉素NS大鼠腎臟miRNA表達譜分析共發(fā)現(xiàn)123個差異表達miRNAs(fold chang＞2.0)，其中有48個miRNA明顯上調(diào)，75個明顯下調(diào)，提示miRAN在NS發(fā)病中有具有重要作用。與李春慶等在PAN腎病大鼠腎臟miRNA芯片結(jié)果比較及驗證，發(fā)現(xiàn)有11個miRNA重合，提示這些可能是NS發(fā)病中具有代表性m

11、iRNA。對這些差異miRNA進行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，miRNAs對腎臟具有多重調(diào)節(jié)作用，對NS水鈉代謝紊亂的多條通路均有調(diào)節(jié)作用，對NS免疫炎癥反應(yīng)、間質(zhì)纖維化及腎臟自噬可能具有重要調(diào)節(jié)作用。
　　4.AQP2及miRNA在腎病綜合征發(fā)病中的作用及真武湯干預(yù)研究
　　(1)結(jié)合生物信息學(xué)預(yù)測手段和芯片結(jié)果，miR-92b及miR-340-3p可能是NS發(fā)病中調(diào)節(jié)AQP2表達的miRNA，真武湯可調(diào)節(jié)腎臟miR-92b的表達

12、，而對miR-340-3p作用不明顯;miR-92b過表達可明顯抑制集合管AQP2蛋白表達，而抑制miR-92b的作用可上調(diào)AQP2蛋白表達，過表達或抑制miR-340-3p對AQP2蛋白表達無明顯作用，提示miR-92b可調(diào)節(jié)AQP2表達。
　　(2)熒光素報告酶實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，AQP2野生型質(zhì)粒與miR-92b模擬物可顯著降低AQP2野生型的報告熒光，而對AQP2預(yù)測靶位點進行突變后，與miR-92b模擬物共孵育后，突變型載體中

13、的報告熒光無明顯下調(diào)作用，提示miR-92b可直接調(diào)節(jié)AQP2表達;過表達miR-92b可抑制集合管細胞增殖，促進細胞早期凋亡，真武湯可抑制miR-92b表達，減少miR-92b上調(diào)誘導(dǎo)的結(jié)合管細胞損傷，提示miR-92b對集合管細胞結(jié)構(gòu)和功能可能具有重要調(diào)節(jié)作用，真武湯可通過調(diào)節(jié)集合管miR-92b及AQP2表達，維持集合管細胞功能穩(wěn)定。
　　結(jié)論:
　　1.真武湯對阿霉素NS大鼠具有一定的保護作用，對蛋白尿、高血脂、低蛋

14、白血癥及腎功能具有一定改善作用，其作用與其調(diào)節(jié)腎臟炎癥反應(yīng)，增強腎臟抗氧化能力可能具有一定關(guān)系;
　　2.真武湯對阿霉素NS大鼠腹水及腎肥大具有明顯的改善作用，可改善腎小管水腫及管型蛋白，這可能與真武湯利尿、促進腎臟尿鈉排泄有關(guān)、降低血清醛固酮水平有關(guān)，提示真武湯對NS水腫具有較好治療作用，對腎小管具有一定保護作用;
　　3.AQP2在阿霉素NS大鼠中表達下調(diào)，但其胞內(nèi)轉(zhuǎn)運機制并未受到抑制，AQP2在集合管細胞頂端質(zhì)膜分布無

15、明顯變化，而阿霉素NS大鼠血清AVP表達較正常組升高，提示AVP可能參與了AQP2短期調(diào)節(jié)，而有其他調(diào)節(jié)機制參與了AQP2的表達抑制調(diào)節(jié);
　　4.NS大鼠腎臟miRNAs與正常對照組大鼠存在較大差異，miRNAs對NS發(fā)病的多個關(guān)鍵環(huán)節(jié)均有重要調(diào)節(jié)作用;
　　5.miR-92b在阿霉素NS大鼠腎臟表達升高，可直接調(diào)控AQP2表達，可能參與了NS中AQP2抑制的調(diào)節(jié)，過表達miR-92b可誘導(dǎo)腎小管上皮細胞凋亡，提示miR-