TNFAIP3siRNA對彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤OCI-LY1細(xì)胞NF-κB活性及藥物敏感性的影響.pdf

1、目的：研究A20的小分子干擾RNA片段(small interfering RNA，siRNA)對彌漫大B細(xì)胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma, DLBCL)OCI-LY1細(xì)胞株增殖及長春新堿(vincristine, VCR)對MDR1表達(dá)和功能的影響。
　　方法：采用RNA干擾技術(shù)沉默A20，設(shè)計(jì)三條針對人A20 mRNA的siRNA序列，經(jīng)過lipofectamine RNAi-MAX轉(zhuǎn)染至

2、OCI-LY1細(xì)胞，用Real time PCR， Western blot檢測轉(zhuǎn)染后OCI-LY1細(xì)胞內(nèi)A20的mRNA和蛋白的表達(dá)，篩選出高效的siRNA序列，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)；MTT法篩選VCR作用細(xì)胞的最佳藥物濃度及作用時(shí)間，了解用藥前后轉(zhuǎn)染細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞體外增殖情況。流式細(xì)胞儀(Flow Cytometry, FCM)了解OCI-LY1細(xì)胞用藥前后的凋亡情況。Real time PCR檢測A20基因及MDR1基因mRNA的表達(dá)情

3、況。Western-blot檢測A20蛋白、NF-κB(p65)蛋白、Pgp蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：1. OCI-LY1細(xì)胞經(jīng)A20 siRNA轉(zhuǎn)染后A20核酸及蛋白表達(dá)均降低，其中siRNA-2序列最明顯，選其進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2. VCR5個(gè)濃度梯度[8、0.8、0.08、0.008、0.0008(μg/ml)]分別作用細(xì)胞，培養(yǎng)24h、48h、72h，篩選出0.008μg/ml,24h為最佳藥物濃度及作用時(shí)間。3. siRNA-2

4、轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)(P=0.000)，VCR刺激后細(xì)胞生長曲線呈下降趨勢，轉(zhuǎn)染細(xì)胞的下降趨勢較未轉(zhuǎn)染細(xì)胞下降緩慢。4.細(xì)胞凋亡檢測：轉(zhuǎn)染細(xì)胞凋亡率明顯低于未轉(zhuǎn)染細(xì)胞，VCR刺激24h后細(xì)胞凋亡率較加藥前明顯增加(P<0.05)，未轉(zhuǎn)染細(xì)胞加藥后的凋亡率比轉(zhuǎn)染細(xì)胞加藥后增高的幅度大(P=0.000)。5.轉(zhuǎn)染后A20 mRNA表達(dá)明顯下降(P=0.000)，MDR1 mRNA的表達(dá)則明顯增強(qiáng)(P=0.000)。加藥前后A20 m

5、RNA表達(dá)無明顯差異(P>0.05)，MDR1的表達(dá)則降低(P<0.05)，未轉(zhuǎn)染細(xì)胞加藥組較轉(zhuǎn)染加藥組降低幅度大(P=0.001)。6.蛋白表達(dá)檢測：轉(zhuǎn)染后A20蛋白表達(dá)明顯降低(P=0.000)，NF-κB(p65)蛋白(P=0.000)和Pgp(P=0.001)表達(dá)則增高。用藥前后A20蛋白和NF-κB(p65)表達(dá)無明顯差異(P>0.05)，但Pgp表達(dá)較用藥前有所降低，未轉(zhuǎn)染細(xì)胞加藥組較轉(zhuǎn)染加藥組降低的幅度大(P=0.008)