p16蛋白對喉癌生長的抑制和對自然殺傷細胞抗腫瘤免疫的調(diào)控.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、喉癌是常見的頭頸部惡性腫瘤,其主要的病理類型為鱗狀細胞癌。
  本課題將研究p16蛋白對人喉癌細胞系Hep-2生長的影響,并從細胞凋亡和細胞周期兩個方面進行機制探討。還將初步探討Hep-2細胞的p16蛋白導入與機體NK細胞抗腫瘤作用之間的關系,為p16作為腫瘤治療靶點的應用提供更為詳實的理論依據(jù)。
  目的:
  1.擴增攜帶野生型p16基因的重組腺病毒載體,并導入人喉癌細胞Hep-2中,觀察p16蛋白的表達情況。

2、r>  2.觀察表達野生型p16蛋白的人喉癌Hep-2細胞的增殖情況,并從細胞凋亡和細胞周期兩方面探討其作用機制。
  3.初步探討表達野生型p16的人喉癌Hep-2細胞對NK細胞殺傷敏感性的變化,同時觀察該細胞對NK細胞殺傷活性的調(diào)控作用。
  方法:
  第一部分 重組腺病毒載體的擴增及其感染喉癌細胞Hep-2后p16蛋白的表達情況
  利用人胚腎細胞系HEK-293擴增攜帶野生型p16基因的重組腺病毒載體;

3、采用293細胞空斑試驗測定重組腺病毒的滴度;重組腺病毒感染Hep-2細胞后,采用流式細胞術和Western blot法檢測p16蛋白的表達情況。
  第二部分 野生型p16蛋白對人喉癌細胞Hep-2體外生長和體內(nèi)生長的影響
  采用CCK8法檢測p16蛋白對Hep-2細胞增殖的影響;流式細胞儀檢測p16蛋白對Hep-2細胞凋亡率和細胞周期的影響;采用電子顯微鏡觀察細胞凋亡的形態(tài);采用Q-PCR法檢測相關細胞凋亡蛋白和細胞周期

4、蛋白的基因表達情況;Hep-2細胞接種于裸鼠背部皮下,采用重組腺病毒瘤內(nèi)注射的方式觀察p16蛋白體內(nèi)抑瘤作用;采用Tunnel法檢測瘤體組織的細胞凋亡情況。
  第三部分 野生型p16蛋白對人喉癌細胞Hep-2與NK細胞之間相互作用的影響
  采用CCK8法檢測p16導入后喉癌Hep-2細胞對NK細胞殺傷敏感性的情況;流式細胞術檢測p16導入后Hep-2細胞表面NK活化受體配體的表達情況;qRT-PCR檢測p16導入后Hep

5、-2細胞IL-6、IFN-γ、IL-10和TGF-β的基因表達情況;ELISA檢測p16導入后Hep-2培養(yǎng)上清中TGF-β的分泌情況;p16蛋白導入后Hep-2細胞培養(yǎng)上清孵育NKL細胞,CCK8法檢測該NKL對Hep-2細胞的殺傷情況;采用添加或阻斷的TGF-β方式,確認Hep-2細胞培養(yǎng)上清的TGF-β是否參與了對NK細胞殺傷功能的調(diào)節(jié)作用。
  結(jié)果:
  第一部分 重組腺病毒載體的擴增及其感染人喉癌細胞Hep-2后

6、p16蛋白的表達情況
  1.利用HEK-293細胞擴增重組腺病毒載體后,采用293細胞空斑試驗測定重組腺病毒的滴度,Ad-p16的滴度為6.5×1010,Ad-LacZ的滴度為4.8×1010。
  2.流式細胞儀檢測p16蛋白表達的結(jié)果顯示,Ad-p16組Hep-2細胞感染重組腺病毒3h、6h、12h和24h時p16蛋白的表達率分別為29.5%、85.0%、92.7%和95.4%。未感染Ad-p16組的Hep-2細胞中無

7、p16蛋白表達。
  3.Western blot檢測結(jié)果也顯示Ad-p16感染的Hep-2有明顯p16蛋白的表達。
  第二部分 野生型p16蛋白對人喉癌細胞Hep-2體外生長和體內(nèi)生長的影響
  1.Hep-2細胞感染重組腺病毒24h,48h,72h,96h后,Ad-p16組Hep-2細胞的增殖抑制率分別為3.003%±0.497(24h),12.031%±1.946(48h)、24.857%±1.473(72h)

8、和30.35%±1.916(96h),與Ad-LacZ比較,均有顯著性差異;
  2.流式細胞術檢測細胞凋亡率,Ad-p16組Hep-2細胞凋亡率從24h的9.99%增加到26.98%(48h)和37.87%(72h),在Ad-LacZ組和Ad-p16組之間進行比較,細胞凋亡誘導率24h時無統(tǒng)計學差異,但48h和72h有明顯的統(tǒng)計學差異;
  3.電子顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)Ad-p16感染的細胞染色質(zhì)濃縮和明顯的凋亡小體。而Ad-

9、LacZ感染的Hep-2細胞少見染色質(zhì)濃縮和凋亡小體。
  4.與Ad-LacZ比較,Ad-p16感染Hep-2細胞后24h,使其G0/G1期細胞明顯增加(48.36%),S期細胞明顯減少(38.26%),而G2/M期細胞無明顯變化;
  5.與Ad-LacZ組比較,促凋亡基因p53、Caspase-8和Bak在Ad-p16組的表達上調(diào),抑凋亡基因Survivin和bcl-2的表達下調(diào),均具有明顯的統(tǒng)計學差異,而Bel-xl

10、的表達無統(tǒng)計學差異;
  6.與Ad-LacZ組相比較,細胞周期蛋白p21和cyclinD1基因在Ad-p16組的表達上調(diào),有明顯的統(tǒng)計學差異,而E2F2和CDK4基因的表達無統(tǒng)計學差異;
  7.裸鼠移植瘤實驗結(jié)果顯示untreated組及Ad-LacZ組小鼠腫瘤生長迅速,且體積與時間呈一定線性關系,兩組在各時間點瘤體體積對比,均無統(tǒng)計學差異。與Ad-LacZ組比較,Ad-p16治療組的腫瘤體積在12天前均無統(tǒng)計差異,但1

11、6天開始,腫瘤生長緩慢,具有統(tǒng)計學差異,且24天出現(xiàn)腫瘤生長消退的趨勢;
  8.喉癌Hep-2細胞移植瘤組織Tunnel染色結(jié)果顯示,untreated組Tunnel陽性細胞百分率為30.56%±1.842,Ad-LacZ組為34.44%±2.572,Ad-p16組為71.78%±3.244,可見Ad-p16組腫瘤組織的凋亡程度明顯增高,與Ad-LacZ組比較,p<0.0001。
  第三部分 野生型p16蛋白對人喉癌細胞

12、Hep-2與NK細胞之間相互作用的影響
  1.用CCK8法檢測NK細胞對Hep-2細胞的殺傷率,結(jié)果顯示,與Ad-LacZ組對比,不同效靶比的條件下,NK細胞對Ad-p16組Hep-2細胞的殺傷效率均有不同程度的提高,且具有統(tǒng)計學差異;
  2.流式細胞術檢測結(jié)果顯示,Ad-p16組Hep-2細胞表面NK細胞活化性受體NKG2D的配體MICA/B和ULBP2的表達均上調(diào),與Ad-LacZ比較,均具有顯著的統(tǒng)計學差異;

13、>  3.采用qRT-PCR檢測結(jié)果顯示,表達p16的Hep-2細胞可下調(diào)IL-10、TGF-β和IL-6的基因表達,上調(diào)IFN-γ的基因表達,與Ad-LacZ比較,均具有顯著的統(tǒng)計學差異;
  4.ELISA檢測結(jié)果顯示,Ad-p16組培養(yǎng)上清中TGF-β的濃度低于另外兩組,且具有明顯的統(tǒng)計學差異;
  5.用不同組Hep-2培養(yǎng)上清孵育NKL細胞后,按照效/靶比4∶1的比例,利用CCK8法檢測NKL的殺傷活性。結(jié)果顯示,

14、單純Hep-2細胞培養(yǎng)上清孵育后的NKL細胞殺傷Hep-2細胞的效率為44.80%±1.277,Ad-LacZ處理組的為44.43%±1.241,二者之間無統(tǒng)計學差異。而Ad-p16組的為77.10%±1.850,與Ad-LacZ組比較,p<0.0001。
  6.Ad-LacZ組培養(yǎng)上清添加anti-TGF-β Ab以阻斷TGF-β的作用,結(jié)果顯示,阻斷后NK細胞的殺傷活性由44.43%±1.241增加到58.33%±1.525

15、,且具有統(tǒng)計學差異。Ad-p16組培養(yǎng)上清補充TGF-β蛋白,結(jié)果顯示,補充后NK細胞的殺傷活性由77.10%±1.850減少到58.73%±2.554,且具有統(tǒng)計學差異。
  結(jié)論:
  1.人喉癌細胞系Hep-2細胞缺失p16蛋白的表達,而重組腺病毒Ad-p16感染Hep-2細胞后,p16蛋白在該細胞的表達率可高達95%左右,補充了Hep-2細胞缺失的p16蛋白,重組腺病毒Ad-p16可為下一步的實驗研究提供良好的物質(zhì)基

16、礎。
  2.野生型p16蛋白在Hep-2細胞的表達可使該細胞體內(nèi)外的生長均受到抑制;野生型p16蛋白可使Hep-2細胞停滯于G0/G1期,減少細胞進入S期,說明p16蛋白可通過調(diào)控細胞周期來發(fā)揮其抑瘤作用;野生型p16蛋白可促進Hep-2細胞的凋亡,且呈時間依賴性;電子顯微鏡顯示存在經(jīng)典的細胞凋亡形態(tài);移植瘤組織Tunnel染色也顯示p16蛋白可促進細胞的凋亡,表明p16蛋白促進腫瘤細胞凋亡是其發(fā)揮抑瘤作用的另一機制。
 

17、 3.野生型p16蛋白在Hep-2細胞的表達,一方面,引起Hep-2細胞高表達NKG2D配體,使其對NK細胞的殺傷敏感性增加;另一方面,Hep-2細胞中細胞因子的表達發(fā)生改變,如下調(diào)TGF-β和IL-10,上調(diào)IFN-γ,進一步實驗證實p16蛋白引發(fā)的TGF-β的下調(diào)可使NK細胞的殺傷活性得到提高。
  意義:
  通過本課題的研究,初步揭示了在p16蛋白抗腫瘤機制中,存在著兩條不同的作用通路,即抑制腫瘤細胞自身的生長速度和

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