可溶性PD-1促進(jìn)對(duì)HPV16E7+腫瘤細(xì)胞的免疫殺傷活性實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:本課題主要研究宮頸癌Caski細(xì)胞中PD-L1的高表達(dá)與HPV16E7的相關(guān)性;并探討通過(guò)sPD-1阻斷PD-1/PD-L1信號(hào)途徑,以及協(xié)同HPV16E7基因?qū)δ[瘤的特異性殺傷淋巴細(xì)胞發(fā)生抑制作用的影響時(shí),使腫瘤特異性淋巴細(xì)胞的生物學(xué)功能得以恢復(fù)的功能作用。
　　方法:(1)利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)本實(shí)驗(yàn)室已建立的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株P(guān)C3-E7中PD-L1的表達(dá)水平。(2)利用PCR技術(shù)克隆獲得人sPD-1的目的基因,并構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒

2、MSCVPIG-sPD-1。(3)將鑒定構(gòu)建成功的真核表達(dá)質(zhì)粒MSCVPIG-sPD-1轉(zhuǎn)染人宮頸癌Caski細(xì)胞,通過(guò)嘌呤霉素篩選出陽(yáng)性克隆,并進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)后,利用Western blot、RT-PCR及免疫熒光技術(shù)鑒定sPD-1在Caski細(xì)胞中的穩(wěn)定表達(dá)。(4)使穩(wěn)轉(zhuǎn)MSCVPIG-sPD-1的克隆細(xì)胞與從人臍帶血分離得到的淋巴細(xì)胞混合共培養(yǎng)后,利用RT-PCR、FCM、LDH殺傷活性測(cè)定來(lái)檢測(cè)共培養(yǎng)的淋巴細(xì)胞的增殖能力及CTL和

3、NK殺傷活性。以轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒組為陰性對(duì)照。(5)利用FCM檢測(cè)淋巴細(xì)胞與穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株P(guān)C3-E7混合共培養(yǎng)后,其增殖及殺傷活性的抑制作用,進(jìn)一步探討sPD-1恢復(fù)HPV16E7對(duì)腫瘤特異性T細(xì)胞的抑制作用。
　　結(jié)果:(1)利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)本實(shí)驗(yàn)室已建立的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株P(guān)C3-E7中PD-L1明顯高表達(dá)于對(duì)照組。(2)成功克隆并構(gòu)建真核表達(dá)載體MSCVPIG-sPD-1質(zhì)粒,經(jīng)酶切和測(cè)序鑒定完全正確。(3)將構(gòu)建好的真核表達(dá)質(zhì)粒MSC

4、VPIG-sPD-1轉(zhuǎn)染人宮頸癌Caski細(xì)胞,并經(jīng)過(guò)嘌呤霉素的篩選陽(yáng)性克隆,經(jīng)過(guò)擴(kuò)大培養(yǎng)后,利用western blot、RT-PCR及免疫熒光鑒定成功獲得MSCVPIG-sPD-1穩(wěn)定克隆細(xì)胞株。(4)利用RT-PCR、FCM、LDH殺傷活性測(cè)定檢測(cè)與MSCVPIG-sPD-1穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞混合共培養(yǎng)的人淋巴細(xì)胞較陰性對(duì)照組明顯增強(qiáng)淋巴細(xì)胞細(xì)胞因子IFN-γ、IL-2、IL-10表達(dá)量明顯增多,淋巴細(xì)胞的增殖能力及殺傷活性都顯著增加。(5

5、)利用FCM檢測(cè)淋巴細(xì)胞與穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株P(guān)C3-3.1(-)-E7混合共培養(yǎng),淋巴細(xì)胞的增殖活性較陰性對(duì)照組顯著抑制。將轉(zhuǎn)入sPD-1基因的PC3-3.1(-)-E7克隆細(xì)胞與淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn),HPV16E7對(duì)淋巴細(xì)胞生物活性的抑制作用得以逆轉(zhuǎn)。
　　結(jié)論:HPV16E7上調(diào)PD-L1表達(dá)是宮頸癌免疫逃逸機(jī)制之一,將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了可溶性PD-1基因的Caski細(xì)胞與人淋巴細(xì)胞共培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)淋巴細(xì)胞的增殖能力及CTL及NK殺傷活性明顯增強(qiáng)