臍帶MSC來(lái)源exosome在皮膚組織再生中的作用及機(jī)制.pdf

1、目的：
　　燒燙傷是日常生活常見(jiàn)的一種創(chuàng)傷，具有高發(fā)病率和死亡率；有報(bào)道證實(shí)臍帶間質(zhì)干細(xì)胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells,hucMSC）加速損傷皮膚的創(chuàng)面愈合，然而MSC的保存、運(yùn)輸及安全性等問(wèn)題限制了其臨床應(yīng)用；外泌體（exosome）是hucMSC旁分泌的主要成分，hucMSC-exosome（hucMSC-Ex）在皮膚組織再生中的作用尚未報(bào)道。本研究旨在探明hucMS

2、C-Ex促進(jìn)深Ⅱ度燙傷的修復(fù)作用以及闡明exosome促進(jìn)皮膚再生過(guò)程中信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的機(jī)制。
　　方法：
　　貼壁法分離培養(yǎng)hucMSC細(xì)胞，蔗糖密度梯度離心法分離hucMSC-Ex，通過(guò)Western blot分析 hucMSC-Ex表面標(biāo)記CD63、CD81和 CD9的表達(dá)，透射電鏡觀察hucMSC-Ex形態(tài)和大小，Nanosight可視型納米顆粒分析儀檢測(cè)hucMSC-Ex的直徑分布情況。80℃熱水燙傷8s制作SD大鼠皮膚

3、深Ⅱ度燙傷模型并應(yīng)用hucMSC-Ex治療，通過(guò)創(chuàng)面大體、HE染色、PCNA和CK19的組織化學(xué)染色等方法分析其修復(fù)效果；Western blot檢測(cè)Bcl-2、Bax表達(dá)和流式細(xì)胞術(shù)Annexin V/PI雙染等技術(shù)分析細(xì)胞凋亡；細(xì)胞計(jì)數(shù)檢測(cè)細(xì)胞增殖；劃痕實(shí)驗(yàn)分析細(xì)胞的遷移；流式細(xì)胞術(shù)PI染色分析細(xì)胞周期；通過(guò)PI3K的抑制劑LY294002證明AKT通路在hucMSC-Ex促進(jìn)皮膚組織再生中的作用；通過(guò)β-catenin抑制劑ICG

4、001證明Wnt/β-catenin信號(hào)的作用；應(yīng)用慢病毒載體介導(dǎo)的shRNA干擾hucMSC-Ex及hucMSC中的Wnt4驗(yàn)證其在深度燙傷修復(fù)中作用。應(yīng)用免疫組化和免疫熒光檢測(cè)皮膚組織中CK15、CK19、Integrinα6、CD44、Oct4及 Nanog的表達(dá)，以標(biāo)記干細(xì)胞的數(shù)量；定量RT-PCR檢測(cè)皮膚組織中膠原I和膠原III的表達(dá)， Masson染色分析組織中膠原的沉積，皮膚組織和真皮細(xì)胞α-SMA的免疫熒光檢測(cè)真皮成纖維

5、細(xì)胞（DFL）向纖維母細(xì)胞的分化；免疫熒光和細(xì)胞核質(zhì)蛋白分離檢測(cè)分析β-catenin和YAP在細(xì)胞中定位；TopFlash檢測(cè)β-catenin的轉(zhuǎn)錄活性，YAP-TEAD4熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)YAP的轉(zhuǎn)錄活性；流式細(xì)胞術(shù)分析CD44在DFL細(xì)胞的表達(dá)情況；定量RT-PCR分析YAP的靶基因CTGF及Cy61的mRNA表達(dá)；免疫組化檢測(cè)p-YAP和YAP在皮膚組織中的表達(dá)和定位；將YAP的Ser127和LATS的Thr1079位點(diǎn)

6、突變?yōu)楸彼?，以證明此磷酸化位點(diǎn)的功能；液相質(zhì)譜分析（LC/MS）分析hucMSC-Ex內(nèi)14-3-3ζ等成分，shRNA敲減14-3-3ζ、α-catenin、YAP、LATS1/2等分子，腺病毒過(guò)表達(dá)14-3-3ζ和 YAP，以證明它們的功能；通過(guò)免疫共沉淀技術(shù)（IP）檢測(cè)14-3-3ζ、YAP、p-LATS等蛋白間相互作用。
　　結(jié)果：
　　成功分離得到hucMSC-Ex，電鏡觀察其形態(tài)為球形，Nanosight分析其

7、直徑為100nm左右，表達(dá)CD63、CD81和CD9等標(biāo)記；成功建立SD大鼠皮膚深I(lǐng)I度燙傷模型，hucMSC-Ex加快深I(lǐng)I度燙傷皮膚創(chuàng)面愈合，促進(jìn)皮膚組織細(xì)胞的增殖和表皮的再生化，同時(shí)促進(jìn)皮膚組織膠原的合理分布；hucMSC-Ex逆轉(zhuǎn)熱激損傷引起的細(xì)胞凋亡，促進(jìn)體外細(xì)胞擴(kuò)增；對(duì)MAPK通路和AKT通路的篩檢發(fā)現(xiàn)，hucMSC-Ex顯著地的活化AKT信號(hào)通路，Luminex檢測(cè)發(fā)現(xiàn)hucMSC-Ex中存在包括VEGF等多種可能活化AK

8、T信號(hào)的細(xì)胞因子；PI3K的抑制劑LY294002可以逆轉(zhuǎn)hucMSC-Ex對(duì)細(xì)胞凋亡的降低作用，但沒(méi)有改變hucMSC-Ex對(duì)皮膚細(xì)胞周期和細(xì)胞遷移的促進(jìn)作用；進(jìn)一步研究表明，hucMSC-Ex可以活化Wnt/β-catenin信號(hào)，并且β-catenin的抑制劑ICG001逆轉(zhuǎn)hucMSC-Ex對(duì)皮膚損傷的修復(fù)作用；將hucMSC-Ex中的Wnt4敲減后（Wnt4-shRNA-Ex），hucMSC-Ex促進(jìn)皮膚細(xì)胞分裂、遷移和加速深

9、II度燙傷創(chuàng)面愈合的作用消失。對(duì)exosome治療深I(lǐng)I度燙傷模型長(zhǎng)期觀察可以發(fā)現(xiàn)，hucMSC-Ex對(duì)皮膚細(xì)胞增殖和β-catenin活化呈現(xiàn)先促進(jìn)后抑制的現(xiàn)象，同時(shí)發(fā)現(xiàn)hucMSC-Ex在修復(fù)的后期限制皮膚干細(xì)胞的擴(kuò)增、真皮細(xì)胞中α-SMA的表達(dá)和膠原III的沉積；體外研究發(fā)現(xiàn)，hucMSC-Ex對(duì)細(xì)胞增殖和β-catenin入核的抑制作用依賴于高細(xì)胞密度培養(yǎng)條件，hucMSC-Ex抑制在此培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)的DFL中α-SMA表達(dá)和膠

10、原的沉積；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，hucMSC-Ex通過(guò)促進(jìn)YAP的磷酸化而誘導(dǎo)YAP的胞質(zhì)內(nèi)滯留，hucMSC-Ex對(duì)β-catenin抑制作用依賴于YAP Ser127位點(diǎn)的磷酸化；對(duì)hucMSC-Ex的液相質(zhì)譜分析（LC/MS）發(fā)現(xiàn)14-3-3ζ，此蛋白在Hippo通路中有調(diào)控作用，hucMSC-Ex中敲減14-3-3ζ的表達(dá)逆轉(zhuǎn)了hucMSC-Ex對(duì)YAP Ser127位點(diǎn)磷酸化的促進(jìn)作用和體外細(xì)胞增殖抑制作用，hucMSC-Ex中過(guò)表

11、達(dá)14-3-3ζ得到相反結(jié)果；將細(xì)胞中LATS干擾后或者將LATS Thr1079位點(diǎn)突變后，14-3-3ζ對(duì)YAP磷酸化的促進(jìn)作用降低；14-3-3ζ、YAP、p-LATS三者可以形成復(fù)合物，YAP與其上游激酶p-LATS的結(jié)合依賴于14-3-3ζ蛋白；應(yīng)用14-3-3ζ敲減的hucMSC-Ex（sh14-3-3ζ-Ex）治療深度燙傷模型發(fā)現(xiàn)，sh14-3-3ζ-Ex比對(duì)照exosome表現(xiàn)出更強(qiáng)的促增殖能力，修復(fù)后皮膚組織表皮層異常