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文檔簡介
1、目的:
本研究以慢性孕前應(yīng)激誘導(dǎo)構(gòu)建產(chǎn)后抑郁(postpartum disease,PPD)小鼠模型,評估母鼠的產(chǎn)后抑郁樣行為。檢測精神分裂癥斷裂基因1(Disrupted in schizophrenia1,DISC1)在產(chǎn)后抑郁母鼠海馬腦區(qū)的基因表達(dá)變化,探討孕前應(yīng)激對母鼠海馬腦區(qū)DISC1-Akt-mTOR信號通路蛋白表達(dá)的影響,以及對于海馬齒狀回神經(jīng)發(fā)生、神經(jīng)內(nèi)分泌的影響,揭示孕前應(yīng)激誘導(dǎo)產(chǎn)后抑郁樣行為的分子機(jī)制。觀察
2、中藥越鞠甘麥大棗湯(越甘)單次給藥對產(chǎn)后抑郁母鼠的快速抗抑郁作用,通過檢測越甘對PPD母鼠海馬DISC1-Akt-mTOR信號通路蛋白表達(dá)的影響,從DISC1信號通路探討中藥越甘發(fā)揮快速治療產(chǎn)后抑郁癥的分子機(jī)制,從而為產(chǎn)后抑郁的預(yù)防治療及新藥研發(fā)提供科學(xué)的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
方法:
1.將Balb/c小鼠隨機(jī)分為2組,空白對照組不給予任何刺激,對照組小鼠給予慢性孕前應(yīng)激,連續(xù)造模3周。應(yīng)激結(jié)束后,空白對照組及對照組
3、隨機(jī)取小鼠雌雄合籠交配懷孕,分娩后形成4組:空白對照組、普通應(yīng)激組、普通分娩組以及應(yīng)激合并分娩組即PPD模型組。于分娩后3周,檢測四組小鼠行為學(xué),包括曠場實(shí)驗(yàn)(Open field test,OFT)、強(qiáng)迫游泳測試(forced swimming test,F(xiàn)ST)、蔗糖消耗測試(sucrose preference test,SPT)、懸尾測試(Tail suspension test,TST)及陌生環(huán)境攝食抑制實(shí)驗(yàn)(novelty
4、suppressed feeding test,NSFT),并計(jì)算分娩后模型組母鼠與普通分娩組的產(chǎn)仔量及仔鼠的存活率,以評價(jià)造模是否成功。此外,檢測四組小鼠產(chǎn)后12周的行為學(xué),以評價(jià)模型是否具有持久穩(wěn)定性。
2.產(chǎn)后3周,行為學(xué)檢測結(jié)束后,取上述四組的母鼠海馬組織,以實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Quantitative Real-Time PCR,Q-PCR)法和western blotting檢測海馬腦區(qū)DISC1的基因及蛋白表達(dá),
5、western blotting法檢測NR1、Akt、mTOR、p70s6k、4E-BP1、GluR1的蛋白表達(dá)情況;取各組母鼠的血清采用ELISA法檢測雌二醇(estradiol,E2)和(皮質(zhì)酮corticosterone,CORT)的水平了解產(chǎn)后抑郁母鼠的內(nèi)分泌情況;采用免疫組織化學(xué)法檢測檢測海馬神經(jīng)再生情況。
3.模型構(gòu)建成功后,模型組母鼠隨機(jī)分為3組,PPD模型組、YG組和Ket組。在產(chǎn)后第20天,YG組單次給予越鞠
6、甘麥大棗湯(越甘),空白對照組和PPD模型組單次給予生理鹽水,Ket組以單次西藥氯胺酮設(shè)為陽性參照組。給藥24小時(shí)后,進(jìn)行行為學(xué)檢測,以評估藥物對于PPD動(dòng)物模型抑郁樣行為的快速干預(yù)作用。此外,檢測單次給藥5天后的動(dòng)物行為學(xué)變化,以評估藥物干預(yù)作用的持久性。
4.藥物干預(yù)24小時(shí)動(dòng)物的行為學(xué)測試結(jié)束后,取四組的母鼠海馬組織,檢測海馬腦區(qū)DISC1的蛋白表達(dá)以及NR1、Akt、mTOR、p70s6k、4E-BP1、GluR1的蛋
7、白表達(dá)情況,研究中藥越甘發(fā)揮快速抗抑郁作用的神經(jīng)分子機(jī)制。
結(jié)果:
1.孕前應(yīng)激誘導(dǎo)產(chǎn)生的PPD模型小鼠表現(xiàn)出一系列抑郁樣表型。產(chǎn)后3周,與空白對照組比較,模型組母鼠的糖水消耗顯著降低;在強(qiáng)迫游泳測試及懸尾測試中,模型組母鼠不動(dòng)時(shí)間顯著增加;模型組母鼠攝食潛伏時(shí)間明顯增加而單位時(shí)間攝食量顯著減少;空白對照組與普通應(yīng)激組、普通分娩組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。模型組母鼠的仔鼠分娩數(shù)目顯著減少,分娩后3周離乳后仔鼠的存活率也顯著下
8、降。此外,行為學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PPD模型小鼠到產(chǎn)后12周仍然表現(xiàn)出一系列抑郁樣行為。
2.產(chǎn)后3周,產(chǎn)后抑郁模型組母鼠海馬DISC1的蛋白表達(dá)及mRNA表達(dá)較空白對照組相比均顯著升高;與空白對照組相比,NR1的蛋白表達(dá)明顯上調(diào)而磷酸化的Akt、mTOR、p70s6k、4E-BP1及突觸后膜蛋白GIuR1的蛋白表達(dá)均顯著下調(diào);此外,與空白對照組相比,模型組母鼠海馬齒狀回神經(jīng)元細(xì)胞的增殖顯著減少;空白對照組與普通應(yīng)激組、普通分娩組之間無
9、統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;模型組母鼠血清的E2及CORT水平與對照組相比則無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
3.單次給予越甘24小時(shí)后,與PPD母鼠模型組相比,越甘組的糖水消耗顯著增加,絕望不動(dòng)時(shí)間明顯降低,陌生環(huán)境攝食抑制實(shí)驗(yàn)中的潛伏時(shí)間顯著縮短,單位時(shí)間攝食量明顯增加,均表現(xiàn)出與西藥氯胺酮相似的結(jié)果。給藥5天后,與PPD模型組相比,越甘組對模型小鼠抑郁樣行為的逆轉(zhuǎn)干預(yù)作用依然存在。
4.單次給予越甘24小時(shí)后,與模型組母鼠相比,越甘組母鼠海
10、馬DISC1的蛋白表達(dá)顯著下調(diào),NR1的表達(dá)也明顯下調(diào),而磷酸化的Akt、mTOR、p70s6k、4E-BP1及突觸后膜蛋白GluR1均顯著上調(diào),與氯胺酮的結(jié)果相一致。
結(jié)論:
1.慢性孕前應(yīng)激誘導(dǎo)的Bal b/c母鼠產(chǎn)后呈現(xiàn)出一系列抑郁樣癥狀,表型顯著且持久穩(wěn)定。小鼠表現(xiàn)為快感缺失、絕望不動(dòng)時(shí)間延長、伴有焦慮以及母愛關(guān)懷行為減少等,并且癥狀可持續(xù)到產(chǎn)后12周,顯著地反映出產(chǎn)褥期抑郁障礙的行為表現(xiàn)。
2.產(chǎn)
11、后3周,孕前應(yīng)激誘導(dǎo)的產(chǎn)后抑郁模型小鼠海馬腦區(qū)DISC1-Akt-mTOR通路表達(dá)異常。小鼠海馬DISC1蛋白表達(dá)及mRNA表達(dá)均異常升高,表明其與產(chǎn)后抑郁癥的發(fā)病密切相關(guān)。模型小鼠海馬NR1的蛋白表達(dá)上調(diào),而Akt、mTOR、p70s6k、4E-BP1及突觸后膜蛋白GluR1的蛋白表達(dá)顯著下調(diào),表明孕前應(yīng)激通過DISC1及NR1介導(dǎo)的活化而抑制了Akt-mTOR的活性,進(jìn)而抑制了下游底物p70s6k及4E-BP1的活性,降低了突觸后膜
12、蛋白GluR1的神經(jīng)可塑性調(diào)節(jié),減少了新生神經(jīng)細(xì)胞的發(fā)生以及神經(jīng)元的保護(hù)和存活,促進(jìn)了產(chǎn)后抑郁癥的發(fā)生。
3.中藥越甘在PPD小鼠模型上發(fā)揮了快速且持久的抗抑郁作用,與氯胺酮相似。中藥越甘單次給藥24小時(shí)后能夠顯著增加產(chǎn)后抑郁模型母鼠的蔗糖消耗量,降低其在強(qiáng)迫游泳及懸尾測試中的不動(dòng)時(shí)間,在陌生環(huán)境攝食抑制實(shí)驗(yàn)中減少潛伏時(shí)間并增加單位時(shí)間的攝食量,并且上述作用可以至少維持5天。
4.調(diào)控海馬DISC1-Akt-mTOR
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