一氧化氮與胰島素抵抗大鼠腦細(xì)胞凋亡間的關(guān)系.pdf

1、研究背景:隨著醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步、生育率的下降，我國(guó)已步入老齡化社會(huì)，腦血管疾病、腦神經(jīng)退行性病變的發(fā)生率逐年升高。腦血管疾病在我國(guó)已處于首位致死原因，給個(gè)人、家庭及社會(huì)帶來(lái)了沉重的負(fù)擔(dān)。而合并有代謝綜合征（Metabolic Syndrome,MS）的人群逐年增加。MS是多種代謝因素發(fā)生異常，聚集于同一個(gè)體的臨床綜合征，易并發(fā)糖尿病及心腦血管疾病。它的發(fā)病率在中國(guó)已經(jīng)超過(guò)14％。
　　研究發(fā)現(xiàn)，腦血管意外、神經(jīng)退行性病變、急性腦損傷

2、及癲癇等均存在神經(jīng)細(xì)胞凋亡（apoptosis）現(xiàn)象。致凋亡因素有很多種，體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)多的一氧化氮也是其中一種致凋亡因子。單硝酸異山梨酯，作為一種外源性一氧化氮供體，廣泛應(yīng)用于合并有代謝綜合征的心血管疾病患者。但它是否有促進(jìn)大腦細(xì)胞凋亡作用及其機(jī)制尚不清楚。
　　本實(shí)驗(yàn)用Wistar大鼠模型，利用單硝酸異山梨酯作為一氧化氮供體，觀(guān)察大鼠腦細(xì)胞凋亡情況，檢測(cè)腦細(xì)胞凋亡基因、抗凋亡基因及其蛋白的表達(dá)情況，從分子水平上探討單硝酸異

3、山梨酯是如何促進(jìn)合并有胰島素抵抗（insulin resistance,IR）大鼠的腦細(xì)胞凋亡的，并幫助尋找有效作用靶點(diǎn)，為治療與腦細(xì)胞凋亡有關(guān)疾病提供了一條新的途徑。
　　材料和方法:
　　1.分組及飼喂方法
　　14周齡Wistar雄性大鼠40只，體質(zhì)量（393.75±11.09）g，各組大鼠之間體重差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。適應(yīng)性喂養(yǎng)7天后，隨機(jī)分為4組，每組10只，分別飼喂普通飼料（對(duì)照組，Control組），高脂高糖

4、飲食(HFHG組)，普通飼料和單硝酸異山梨酯（ISMN組），以及同時(shí)給予HFHG和ISMN（聯(lián)合喂養(yǎng)組，UNITED組）。其中，ISMN按4.2mg/Kg劑量灌胃,不給予ISMN的大鼠使用生理鹽水灌胃。HFHG配方為：普通飼料79％，蔗糖10%，豬油5％，膽固醇5％，石膽酸1%。上述方法喂養(yǎng)12周。
　　2.觀(guān)察指標(biāo)
　　（1）血標(biāo)本用于檢測(cè)血糖濃度（葡萄糖氧化酶法）及胰島素含量（放射免疫法），以此計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)。

5、>　?。?）采用硝酸還原酶法測(cè)定腦組織NO及iNOS含量。
　?。?）RT-PCR檢測(cè)方法測(cè)定Bcl-2、Bax mRNA表達(dá)含量，Western blot檢測(cè)方法測(cè)定Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)含量。
　?。?）TUNEL法觀(guān)察放入4%甲醛溶液中腦組織形態(tài)及凋亡細(xì)胞的數(shù)量。
　　結(jié)果:
　　1.HOMA-IR與Control組大鼠相比，添加單硝酸異山梨酯飲食、高脂高糖飲食大鼠及聯(lián)合飲食大鼠HOMA-IR均升高，差

6、異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。（表1）
　　2.腦組織中NO含量
　　與Control組大鼠相比，HFHG組、ISMN組及UNITED組大鼠NO含量均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；UNITED組大鼠NO含量高于HFHG組、ISMN組大鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。（表2）
　　3.腦組織中iNOS含量
　　與Control組大鼠相比，ISMN組、HFHG組及UNITED組大鼠iNOS含量均升高

7、，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；UNITED組大鼠iNOS含量高于HFHG組、ISMN組大鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。（表3）
　　4.HOMA-IR與NO含量的相關(guān)性分析
　　HFHG組大鼠組，NO含量與HOMA-IR呈正相關(guān)，r＝0.739，P<0.05。ISMN大鼠組，HOMA-IR與腦組織NO含量與呈顯著正相關(guān)，r＝0.922，P<0.01。（圖1）
　　5.各組大鼠腦細(xì)胞凋亡指數(shù)和腦組織形態(tài)學(xué)觀(guān)

8、察
　　TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)腦細(xì)胞凋亡光鏡下可以觀(guān)察到處于凋亡狀態(tài)的細(xì)胞細(xì)胞核呈棕黃色，而正常的細(xì)胞細(xì)胞核不被染色。4組大鼠腦細(xì)胞均能觀(guān)察到部分凋亡細(xì)胞，而ISMN組、HFHG組及UNITED組大鼠腦細(xì)胞凋亡增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05。（表4、圖2）
　　6.各組大鼠腦組織Bcl-2、Bax mRNA與蛋白表達(dá)
　　與Control組大鼠相比，ISMN組、HFHG組及UNITED組大鼠Bcl-2

9、mRNA表達(dá)水平均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與Control組大鼠相比，ISMN組、HFHG組及UNITED組大鼠Bax mRNA表達(dá)水平均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。（表5、圖3）
　　與Control組大鼠相比，ISMN組、HFHG組及UNITED組大鼠Bcl-2 mRNA蛋白表達(dá)水平均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與Control組大鼠相比，ISMN組、HFHG組及UNITED組大鼠Bax