在重組大腸桿菌和盤基網(wǎng)柄菌中高效表達(dá)可溶性人類Fas配體.pdf

1、人類Fas配體(hFasL)是一種細(xì)胞凋亡因子，屬于腫瘤壞死因子家族，是死亡蛋白Fas的天然受體。它是一種Ⅱ型跨膜糖蛋白，通過與細(xì)胞表面的Fas受體結(jié)合可引起Fas表達(dá)陽性的細(xì)胞凋亡。由于可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，hFasL在腫瘤、AIDS、感染性疾病等的治療中有著廣闊的應(yīng)用前景。 本文分別在原核表達(dá)系統(tǒng)大腸桿菌和真核表達(dá)系統(tǒng)盤基網(wǎng)柄菌中以可溶性形式實現(xiàn)了hFasL的高水平表達(dá)。從重組盤基網(wǎng)柄菌AX3-pLu8中提取重組質(zhì)粒pMB

2、74-hFasL作為模板，PCR成功擴(kuò)增編碼hFasL胞外區(qū)第141～281個氨基酸的基因序列。選用質(zhì)粒pET32a(+)作為原核表達(dá)載體(其上的TrxA融合標(biāo)簽可以改善重組蛋白的可溶性)，將hFasL基因插入質(zhì)粒pET32a(+)的多克隆位點，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，成功構(gòu)建了重組表達(dá)菌株E. coli BL21(DE3)-pET32a-hFasL。測序結(jié)果表明，插入的目的目的基因大小為438bp，經(jīng)序列比對發(fā)現(xiàn)此片段與人類Fas配體序列的同源

3、性為100％，最終證明重組菌株E. coli BL21(DE3)-pET32a-hFasL構(gòu)建成功。將此重組菌株接種至LB培養(yǎng)基，使用IPTG作為誘導(dǎo)劑，通過考察誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)劑濃度和誘導(dǎo)時間等因素，獲得最適誘導(dǎo)條件，在此條件下hFasL表達(dá)量可達(dá)1.0mgL-1。 采用10 L發(fā)酵罐，選用全合成培養(yǎng)基SIH發(fā)酵培養(yǎng)盤基網(wǎng)柄菌AX3-FH。間歇培養(yǎng)至80 h，菌體密度最大可達(dá)8.3×107ml-1，hFasL最高產(chǎn)量為420μ