重組草酸降解酶基因的乳酸菌治療高草酸尿癥的實驗研究.pdf

1、目的：草酸鈣結石是泌尿外科最常見的疾病之一，高草酸尿癥是其主要致病因素，目前尚無有效的防治方法。腸道吸收的食源性草酸是尿草酸的重要來源，減少食物中草酸含量可有效降低尿草酸排泄量。草酸脫羧酶（ oxalate decarboxylase/ODC）和草酸氧化酶(oxalate oxidase/OxO)是自然界中存在的兩種特異性草酸降解酶，在預防高草酸尿方面具有廣泛的應用前景。本研究將 ODC和OxO基因轉入乳酸菌（lactic acid b

2、acteria/Lab）中，使其表達草酸降解酶，達到持續(xù)有效降解草酸的效果，通過口服途徑降解食物中的草酸，減少腸道草酸的吸收，降低尿草酸排泄量，從而預防草酸鈣結石的形成。
　　方法：提取ODC及OxO編碼基因，將基因片段與Lab表達質粒pMG36e相連接，為了提高表達效率，在編碼基因前插入pH誘導的強啟動子p170；將重組表達質粒通過電轉化轉入Lab菌株MG1363中。在含有100mmol/L草酸的MRS培養(yǎng)基中于37℃條件下靜置

3、培養(yǎng)轉基因乳酸菌48h，利用分光光度計和高效液相色譜儀測量不同時間的培養(yǎng)基的吸光度和草酸濃度，檢測Lab的生長情況及降解草酸效率；用含5％草酸食物喂養(yǎng)SD大鼠，構建高草酸尿模型，同時轉基因乳酸菌灌胃治療1個月，分別在第0、7、14、21、28天收集24h尿液，測量尿液中草酸含量，并在第30天處死大鼠，取出腎臟，切片固定，利用硝酸銀染色，觀察腎臟中草酸鈣結晶形成情況。
　　結果：轉ODC基因乳酸菌（ODC-Lab）和轉OxO基因乳酸

4、菌（OxO-Lab）可在高草酸濃度培養(yǎng)基中生長，ODC-Lab可有效降解培養(yǎng)基中草酸，插入強啟動子p170（p170-ODC-Lab）可提高草酸降解效率；而OxO-Lab和p170-OxO-Lab并無有效降解草酸的功能；在動物實驗中，ODC-Lab和p170-ODC-Lab灌胃治療可明顯緩解高草酸尿并預防草酸鈣結石形成，其中p170-ODC-Lab效果更佳，相反OxO-Lab和p170-OxO-Lab無防治高草酸尿癥和草酸鈣結石的功效。