長正五聚蛋白3參與鈣化性主動脈瓣膜病發(fā)生發(fā)展過程的研究.pdf

1、目的：
　　鈣化性主動脈瓣膜病(Calcific aortic valve disease,CAVD)嚴重危害人類健康,近年來其發(fā)病率呈增高趨勢。在西方國家，年齡大于65歲人群中，大約有2.5％的人主動脈瓣膜有不同程度的硬化、狹窄，其中一些人需要行心瓣膜置換手術(shù)治療。瓣膜間質(zhì)細胞是心臟瓣膜中的主要細胞，起支架作用，對維持瓣膜結(jié)構(gòu)完整性有重要作用。越來越多的研究證實主動脈瓣膜鈣化并不是被動的鈣磷無機鹽沉積，而是多種細胞和多種信號通路

2、介導(dǎo)的主動性調(diào)控過程，其病理生理過程包括脂質(zhì)沉積等多種病理生理過程。
　　長正五聚蛋白3屬于正五聚蛋白家族成員，又稱腫瘤壞死因子刺激基因14（tumor necrosis factor-stimulated gene14,TSG14）。PTX3參與細胞凋亡、炎癥、免疫防御以及包括冠狀動脈粥樣硬化、缺血再灌注損傷、急性主動脈夾層、充血性心力衰竭等多種心血管疾病。PTX3由多種細胞產(chǎn)生(包括DCs、巨噬細胞、成纖維細胞及其他多種細胞)

3、。目前PTX3血漿水平異常已被證實與多種心血管疾病有關(guān),包括動脈粥樣硬化、缺血再灌注損傷、充血性心力衰竭、主動脈瓣狹窄等。在鈣化性主動脈瓣膜中，已發(fā)現(xiàn)多種細胞包括瓣膜間質(zhì)細胞均可表達PTX3，PTX3可能參與鈣化性主動脈瓣膜病的發(fā)生發(fā)展，然而具體作用機制有待研究。
　　我們推測，oxLDL通過激活相關(guān)信號通路促進PTX3的表達，從而誘導(dǎo)瓣膜間質(zhì)細胞向成骨細胞分化，促進主動脈瓣膜鈣化進展。本實驗通過體外不同措施干預(yù)瓣膜間質(zhì)細胞，利用

4、分子生物技術(shù)，證實以上假設(shè)，并探討其中的機制。
　　方法與結(jié)果：
　　免疫組化染色實驗設(shè)計：通過病史，臨床表現(xiàn)，體格檢查、心臟彩超及其他相關(guān)檢查，年齡＞60歲，診斷主動脈瓣退行性病變的瓣膜標本20例，排除風濕性心臟瓣膜、感染性心內(nèi)膜炎瓣膜，為實驗組。取心臟移植術(shù)中無主動脈瓣膜病變的瓣膜12例為對照組。術(shù)中取下瓣膜后，立即用4％多聚甲醛固定24小時后石蠟包埋，普通切片機切成4μm厚縱向置于載玻片上，行免疫組化染色，包括α-SM

5、A、CD68、RUNX2、PTX3。
　　與對照組比較，鈣化主動脈瓣膜中α-SMA、CD68、RUNX2、PTX3水平均顯著提高（P＜0.05）。以上結(jié)果表明：在鈣化的主動脈瓣膜中PTX3表達增加與成骨因子表達增加表現(xiàn)為相同的變化趨勢。
　　細胞實驗部分設(shè)計：體外培養(yǎng)AVICs，用不同濃度oxLDL（25、50、100 ug/mL）干預(yù)24h，免疫印跡法檢測PTX3，干預(yù)48小時后檢測RUNX2、Osteocalcin的表達

6、，用oxLDL（100 ug/mL）干預(yù)不同時間后，檢測PTX3表達;采用Toll4樣受體靶向小干擾RNA（TLR4 siRNA）及PTX3靶向小干擾RNA（PTX3 siRNA）轉(zhuǎn)染VICs沉默TLR4及PTX348h，蛋白免疫印跡法檢測Toll4和PTX3的表達；Toll4 siRNA及PTX3siRNA轉(zhuǎn)染AVICs48h后再給予oxLDL（100 ug/mL）干預(yù)AVICs，蛋白免疫印跡法檢測PTX3、RUNX2、Osteoca

7、lcin的表達水平，以及PTX3 siRNA轉(zhuǎn)染AVICs48h后再給予oxLDL（100 ug/mL）干預(yù)AVICs1周后行茜素紅染色；OxLDL干預(yù)10min、30min、1h、2h、4h后，蛋白免疫印跡法檢測pNF-kB、pERK1/2水平；用NF-kB通路阻滯劑BAY11-7082和ERK1/2通路阻滯劑PD98059預(yù)先1h加入培養(yǎng)基，再分別用oxLDL及重組人PTX3干預(yù)48h后，蛋白免疫印跡法檢測RUNX2、Osteoca

8、lcin的表達水平；用重組人PTX3蛋白（100nmol）干預(yù)VICs10min、30min、1h、2h、4h后，蛋白免疫印跡法檢測pNF-kB、pERK1/2水平，干預(yù)48h后檢測RUNX2、Osteocalcin的表達水平。實驗結(jié)果：1.不同濃度oxLDL干預(yù)AVICs表達PTX3、RUNX2、Osteocalcin均呈濃度依賴性增加，用oxLDL(100ug/mL)干預(yù)時，PTX3在24h的表達達到最高峰（P<0.01）；2.TL

9、R4 siRNA、PTX3 siRNA組較對照組比較可有效沉默Toll4、PTX3的表達（P<0.01）；3.與對照組比較，oxLDL+Toll4 siRNA組AVICs PTX3、Runx2、osteocalcin的表達明顯減少；與對照組比較，oxLDL+PTX3 siRNA組AVICs成骨因子的表達明顯減少（P<0.05），茜素紅染色鈣結(jié)節(jié)明顯減少；4.沉默Toll4和PTX3后pNF-kB、pERK1/2、RUNX2、Osteoc

10、alcin的表達水平明顯減少（P<0.01）；5.與對照組比較，rhPTX3組成骨因子表達明顯上調(diào)，與單純oxLDL組比較，oxLDL+rhPTX3進一步上調(diào)成骨因子的表達；6.與單純rhPTX3組比較，BAY11-7082+rhPTX3組、PD98059+rhPTX3組成骨因子表達減少。
　　結(jié)論：
　　本研究初步探討了PTX3在主動脈瓣膜鈣化中的作用及機制：OxLDL通過激活TLR4，上調(diào)PTX3的表達。PTX3通過促進