CRISPR-Cas9修復(fù)純合突變的β-地貧iPSCs在NSI小鼠體內(nèi)的研究及β-地貧兔模型的建立.pdf

1、背景：β-地中海貧血(β-地貧)是世界上最常見的遺傳病之一。β-地中海貧血是由于β-珠蛋白基因(HBB)點(diǎn)突變或者小片段缺失引起β-珠蛋白鏈合成減少或缺乏,從而導(dǎo)致血紅蛋白四聚體α-鏈/非α-鏈之間失去平衡所引起的一種中重度溶血性單基因遺傳病。全球約有4.5％的攜帶者，而我國南方的廣東、廣西等省份尤為多見，其中廣東省高達(dá)10%，雖然產(chǎn)前診斷的飛速發(fā)展可以防止很多地貧患兒的出生,但是我國每年仍有不少的患兒出生。重型β-地中海貧血患兒需要長(zhǎng)

2、期輸血及螯合鐵治療，并且不規(guī)范治療多在青少年死亡，給社會(huì)和家庭帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)和精神心理負(fù)擔(dān)。目前,造血干細(xì)胞移植是唯一的根治方法,但供體來源不足是治療的瓶頸，許多β-地中海貧血患者因無合適的供體而得不到有效的治療。另外，基因治療，通過病毒導(dǎo)入正常 HB基因到病人體內(nèi)是一個(gè)有希望的治療方案，但是其在臨床使用仍然面臨著病毒整合的長(zhǎng)期安全性問題。通過基因修復(fù)后的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs）進(jìn)行誘導(dǎo)造血分化為造血干細(xì)胞后輸入患者體內(nèi)是近年來發(fā)

3、展起來的被認(rèn)為最有希望治療β-地貧的新方法。近期的一些體外研究已證明其修復(fù)后的iPSCs可正常分化為造血干細(xì)胞并且可繼續(xù)成熟為具有表達(dá)HBB珠蛋白的紅細(xì)胞。雖然這種方法是患者自體細(xì)胞，因此細(xì)胞來源不存在倫理問題，也沒有免疫排斥，但是它仍有外源基因隨機(jī)整合、致癌可能和基因修復(fù)過程導(dǎo)致脫靶效應(yīng)引起基因突變等風(fēng)險(xiǎn)，因此，在臨床應(yīng)用前，必須對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)研究及動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行安全性及有效性的探討。
　　第一部分CRISPR/Cas9修復(fù)純合

4、突變的β-地貧iPSCs在NSI小鼠體內(nèi)的研究
　　目的：基因修復(fù)后的β-地中海貧血（β-地貧）誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs）定向造血干細(xì)胞分化后自體移植是一個(gè)目前最為理想的治療方法。因此本部分旨在探討（1）CRISPR/Cas9修復(fù)純合突變的β-地貧iPSCs在NSI小鼠體內(nèi)是否可以分化、存活和紅細(xì)胞表達(dá)beta珠蛋白及其是否導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。（2）不同組織來源（皮膚及外周血）的iPSCs造血分化的體內(nèi)外差異及腫瘤形成的差異。

5、>　　方法：
　　1.利用 CRISPR/Cas9基因修復(fù)的方法對(duì)使用仙臺(tái)病毒建立的非整合純合突變的β-地貧iPSCs進(jìn)行基因修復(fù)。并對(duì)修復(fù)后的β-地貧iPSCs進(jìn)行多能性檢測(cè)。
　　2.利用OP9（小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞）共培養(yǎng)的方法對(duì)實(shí)驗(yàn)用到的各種iPSCs（包括正常人皮膚來源的 iPSCs（ niPSCs-1）、正常人血液來源的 iPSCs（niPSCs-2）、純合突變的β-地貧 iPSCs（piPSCs）、純合突變修復(fù)后的

6、 iPSCs（ciPSCs）和人胚胎干細(xì)胞（hESCs））進(jìn)行造血分化。
　　3.通過磁珠分選CD34陽性的造血干細(xì)胞，移植前12-24小時(shí)，用X-射線劑量1 Gy,劑量率1Gy/min對(duì)NOD-SCID-IL2Rg-/-(NSI)照射后進(jìn)行CD34造血干細(xì)胞骨髓移植，每只小鼠注射5X10^5個(gè)細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)共分7組，分別為：niPSCs-1組（n=3），niPSCs-2組（n=4），piPSCs組（n=5），ciPSCs組（n=5）

7、，hESCs組（n=4），臍帶血組（umbilical cord blood, UCB）（n=3）和陰性對(duì)照組（n=4）。
　　4.0-5周，每周對(duì)小鼠進(jìn)行血常規(guī)檢測(cè)。
　　5.0-10周，每周對(duì)小鼠進(jìn)行CD71、CD3、CD45和CD235a進(jìn)行流式檢測(cè)，每間隔一周對(duì) CD43、CD31、CD8等流式標(biāo)志物檢測(cè)。
　　6.第10周時(shí)對(duì)小鼠進(jìn)行解剖，流式檢測(cè)骨髓（分別檢測(cè)左右腿股骨）的CD43、CD31、CD71、CD

8、3、CD34、CD45、CD235a;人SRY基因檢測(cè)；并對(duì)肝肺腎及骨髓進(jìn)行病理檢測(cè)。
　　7.對(duì)小鼠的外周血進(jìn)行人HBB珠蛋白檢測(cè)：小鼠外周血進(jìn)行CD235a與β珠蛋白流式檢測(cè)；先對(duì)小鼠外周血進(jìn)行CD235a標(biāo)記物分選，再把分選出的細(xì)胞進(jìn)行Western blot檢測(cè)β珠蛋白。
　　結(jié)果：
　　1.利用CRISPR/Cas9基因修復(fù)后的β-地貧iPSCs保持正常核型、多能性標(biāo)記，能形成畸胎瘤及向造血干細(xì)胞分化。

9、>　　2.正常人皮膚來源的 iPSCs（ niPSCs-1）、正常人血液來源的 iPSCs（niPSCs-2）、純合突變的β-地貧 iPSCs（piPSCs）、純合突變修復(fù)后的 iPSCs（ciPSCs）和hESCs通過OP9共培養(yǎng)的方法都能進(jìn)行造血分化；正常人血液來源的iPSCs比正常人皮膚來源的iPSCs的造血分化CD34陽性效率高。
　　3. X-射線半致死量照射后的NSI小鼠第一周時(shí)HB（血紅蛋白）含量比未照射時(shí)（0周）下

10、降，其余各項(xiàng)指標(biāo)未見明顯差異；第二周時(shí)，血常規(guī)中的HB含量的比較示：niPSCs-1、niPSCs-2、ciPSCs、hESCs、UBC組血紅蛋白含量比piPSCs及正常對(duì)照組高,但未見明顯差異，其余各項(xiàng)指標(biāo)未見明顯差異；而第三周后上述各組間HB含量比較未見明顯差異。niPSCs-1與niPSCs-2組各周血常規(guī)參數(shù)進(jìn)行相比較，均未見明顯差異。
　　4.每周對(duì)小鼠進(jìn)行CD71、CD3、CD45和CD235a，每間隔一周對(duì) CD43

11、、CD31、CD8等流式標(biāo)志物檢測(cè)示處理組niPSCs-1、niPSCs-2、ciPSCs、hESCs、UBC、piPSCs各組均可檢測(cè)。niPSCs-1與niPSCs-2組各周進(jìn)行上述標(biāo)志物相比較，均未見明顯差異。
　　5.第10周時(shí)對(duì)小鼠進(jìn)行解剖，流式檢測(cè)骨髓（分別檢測(cè)左右腿股骨）CD43、CD31、CD71、CD3、CD8、CD45、CD235a等標(biāo)志物進(jìn)行流式檢測(cè)示處理組niPSCs-1、niPSCs-2、ciPSCs、h

12、ESCs、UBC、piPSCs各組均可檢測(cè)，niPSCs-1與niPSCs-2組各周進(jìn)行上述標(biāo)志物相比較，均未見明顯差異。
　　6.第10周時(shí)對(duì)小鼠進(jìn)行解剖，各組小鼠的肝肺腎及骨髓進(jìn)行病理檢測(cè)均未見明顯異?；蚰[瘤形成。
　　7. iPSCs分化的造血干細(xì)胞可以在小鼠體內(nèi)存活并且分化表達(dá)β珠蛋白：小鼠外周血進(jìn)行CD235a與β珠蛋白流式檢測(cè)結(jié)果示：ciPSCs組高于piPSCs組（P<0.01）；niPSCs-1與niPSCs

13、-2組未見明顯差異。小鼠外周血分選出的CD235a+細(xì)胞進(jìn)行Western blot檢測(cè), ciPSCs組高于piPSCs組β珠蛋白表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　1.利用CRISPR/Cas9基因修復(fù)后的β-地貧iPSCs保留干細(xì)胞特性，不影響干細(xì)胞的后續(xù)研究。
　　2.血液來源的iPSCs比皮膚來源的iPSCs在體外具有更高的分化效率；但是在小鼠體內(nèi)未見明顯差異；在腫瘤形成方面也未見差異。
　　3. UCB、修復(fù)前后

14、的β-地貧iPSCs、hESCs造血分化后的造血干細(xì)胞在小鼠體內(nèi)均能存活及分化為紅細(xì)胞。
　　4. UCB、修復(fù)前后的β-地貧iPSCs、hESCs造血分化后的造血干細(xì)胞在小鼠體內(nèi)均沒有形成腫瘤，具有安全性。
　　5.修復(fù)后的β-地貧iPSCs造血干細(xì)胞在小鼠體內(nèi)可以表達(dá)β珠蛋白。
　　第二部分利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)建立β-地貧兔疾病模型
　　目的：目前，缺乏一種有效的評(píng)價(jià)β-地貧等血液疾病iPSCs分化

15、的造血干細(xì)胞在體內(nèi)研究的動(dòng)物模型。因此本部分旨在探討利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)結(jié)合胚胎顯微注射技術(shù)建立β-地貧兔疾病模型，為研究基因修復(fù)后β-地貧病人來源iPSCs分化的造血干細(xì)胞移植治療β-地貧的安全性和有效性評(píng)估提供理想的動(dòng)物模型。
　　方法：針對(duì)兔Hbb基因第二外顯子設(shè)計(jì)gRNA靶位點(diǎn)，將Cas9和gRNAs體外轉(zhuǎn)錄為mRNA顯微注射入兔受精卵，移植代孕母兔后可獲得Hbb基因敲除的β-地中海貧血家兔模型，對(duì)其進(jìn)行基因型檢

16、測(cè)以及貧血表型評(píng)估。
　　結(jié)果：體外胚胎注射Cas9（200ng）、gRNA1（20ng）、gRNA2（20ng）對(duì)gRNAs活性進(jìn)行檢測(cè)，共注射30個(gè)受精卵，其中16個(gè)發(fā)育至囊胚，9個(gè)測(cè)序成功，經(jīng)檢測(cè)全部發(fā)生敲除，證明gRNA切割效率較高。將Cas9、gRNAs以相同的濃度注射入30個(gè)受精卵移植假孕母兔，在移植的10只母兔中，僅有3只懷孕并且全部流產(chǎn)，推測(cè)其原因是 gRNA活性太高導(dǎo)致 Hbb基因雙敲致死。然后將Cas9（100