磷酸三(2,3-二氯丙基)酯暴露誘發(fā)NRK-52E細(xì)胞纖維化的體外研究.pdf

1、自2004年禁止使用五溴聯(lián)苯醚混合物阻燃劑以來(lái)，有機(jī)磷阻燃劑(organophosphorus flame retardants,OPFR)作為替代品開(kāi)始被廣泛生產(chǎn)和使用。有機(jī)磷阻燃劑在水體環(huán)境及生物體中的檢出率越來(lái)越高，而其對(duì)生物體及生態(tài)環(huán)境的潛在毒性效應(yīng)還知之甚少。
　　對(duì)于處于食物鏈頂端的水生哺乳動(dòng)物如中華白海豚而言，腎臟對(duì)于其正常生理活動(dòng)具有重要的意義，不僅可以維持水、酸堿及電解質(zhì)平衡，還具有內(nèi)分泌功能，可清除體內(nèi)代謝廢物

2、及外界毒物，因此研究有機(jī)磷阻燃劑對(duì)水生哺乳動(dòng)物腎臟的毒理效應(yīng)，對(duì)于評(píng)估阻燃劑的環(huán)境效應(yīng)具有重要的意義。鑒于目前無(wú)法在中華白海豚體內(nèi)進(jìn)行活體實(shí)驗(yàn)，也未有成熟的中華白海豚腎臟細(xì)胞系，所以我們選有陸生代表性哺乳動(dòng)物大鼠的腎小管上皮細(xì)胞作為我們實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象。
　　本研究利用磷酸三(2,3-二氯丙基)酯(tri(2,3-dichloropropyl)phosphate, TDCPP)對(duì)大鼠腎小管上皮細(xì)胞(NRK-52E)的毒性暴露實(shí)驗(yàn)，研

3、究TDCPP對(duì)細(xì)胞活性及基因表達(dá)變化情況，來(lái)探討TDCPP是否具有引起腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)換(epithelial-mesenchymal transition,EMT)的生物毒性，進(jìn)而對(duì)環(huán)境保護(hù)工作提供基本的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。
　　研究結(jié)果表明：
　　1、TDCPP影響NRK-52E細(xì)胞的形態(tài)，如使細(xì)胞變圓，染色質(zhì)發(fā)生固縮；抑制細(xì)胞活性，細(xì)胞活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NRK-52E細(xì)胞經(jīng)TDCPP暴露處理12、24、36、4

4、8、60、72h后，TDCPP對(duì)細(xì)胞活性的有效半數(shù)抑制濃度IC50分別為60.58、25.72、17.20、6.55、4.64、1.78μM，隨著TDCPP對(duì)NRK-52細(xì)胞作用時(shí)間的延長(zhǎng)，IC50不斷降低；
　　2、TDCPP可以誘導(dǎo)NRK-52E細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基生成量增加，形成氧化應(yīng)激反應(yīng)，破壞細(xì)胞原有的活性氧自由基生成與清除之間的平衡狀態(tài)。過(guò)量的活性氧可以通過(guò)絲裂原活化蛋白激酶信號(hào)通路和c-Jun氨基末端激酶信號(hào)通路誘導(dǎo)下

5、游轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1的生成，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)成分的過(guò)度積累，進(jìn)而導(dǎo)致纖維化；
　　3、50μM TDCPP暴露處理72h，NRK-52E細(xì)胞轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）mRNA的誘導(dǎo)表達(dá)量是空白對(duì)照組的149％，而對(duì)TGF-β1受體mRNA的誘導(dǎo)量是空白對(duì)照組的246%。TGF-β1不僅可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過(guò)程的發(fā)生，還可以活化處于靜止?fàn)顟B(tài)的間充質(zhì)成纖維細(xì)胞，促進(jìn)上皮細(xì)胞

6、向肌成纖維細(xì)胞的分化過(guò)程，通過(guò)與其膜受體結(jié)合，通過(guò)TGF-β/SMAD信號(hào)通路誘導(dǎo)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換，促進(jìn)纖維化發(fā)生；
　　4、TDCPP可以誘導(dǎo)上皮細(xì)胞發(fā)生上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換，TDCPP抑制在上皮細(xì)胞中起粘附作用的上皮細(xì)胞鈣粘蛋白及緊密連接蛋白-1（fibronectin-1,FN-1） mRNA的表達(dá)量，50μM TDCPP在六個(gè)時(shí)間階段內(nèi)的暴露處理對(duì)上皮鈣黏蛋白（E-cadherin）mRNA的表達(dá)都有顯著的抑制效果，平均僅為空

7、白對(duì)照組的22.7%，50μM TDCPP暴露處理72h后緊密連接蛋白（zonula occludens-1, ZO-1）mRNA的表達(dá)量為空白對(duì)照組的50.7%；對(duì)于間充質(zhì)波形蛋白的mRNA而言，50μM TDCPP暴露處理72h后的表達(dá)量為空白對(duì)照組的301%。上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換過(guò)程中生成大量的間充質(zhì)細(xì)胞，使纖維化過(guò)程加重；
　　5、50μM TDCPP暴露處理72h后α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle acti

8、n,α-SMA）的表達(dá)量為空白對(duì)照組的133%；α-SMA是肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志分子，其表達(dá)上調(diào)，表明肌成纖維細(xì)胞被活化，進(jìn)一步產(chǎn)生纖維化細(xì)胞。
　　6、TDCPP還可以破壞胞外基質(zhì)的穩(wěn)定性，誘導(dǎo)FN-1 mRNA的表達(dá)量，促進(jìn)其過(guò)度沉積，導(dǎo)致纖維化的發(fā)生；同時(shí)，幾乎完全抑制了Ⅰ型膠原蛋白（collagen1,Col1）和Ⅲ型膠原蛋白（collagen3,Col3）mRNA的表達(dá)，破壞了細(xì)胞之間的緊密連接和穩(wěn)定的微環(huán)境。