基于MAPKs信號通路M1-2對甲型流感病毒H1N1誘導(dǎo)小鼠氣管上皮細(xì)胞β-防御素產(chǎn)生的作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：觀察重組甲型流感病毒H1N1的基質(zhì)蛋白1（rM1）和2（rM2）對小鼠氣管上皮細(xì)胞β-防御素產(chǎn)生的作用，以及基于絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族p38、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK1/2）和c-Jun氨基端激酶（JNK)信號通路的作用機(jī)制。
　　方法：體外培養(yǎng)原代小鼠氣管上皮細(xì)胞，利用抗角蛋白抗體進(jìn)行免疫熒光鑒定。實(shí)驗(yàn)共分為6組：rM1組（200ng/mL）、rM2組（200ng/mL）、病毒組（2×TCID50）、rM1+

2、病毒組、rM2+病毒組、正常對照組。在相同條件下提前1小時(shí)分別給予p38抑制劑（SB203580）、ERK1/2抑制劑（UO126）、JNK抑制劑（SP600125）進(jìn)行信號通路干預(yù)。各組均在作用4小時(shí)、8小時(shí)、24小時(shí)后進(jìn)行相應(yīng)指標(biāo)檢測。HE染色觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，采用RT-PCR、Western blot和ELISA法檢測各組β-防御素3、β-防御素4、IFN-γ、P-p38、p38、P-ERK1/2、ERK1/2、P-JNK、JN

3、K各指標(biāo)的基因和蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1、免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見培養(yǎng)的細(xì)胞胞漿中有綠色熒光的角蛋白表達(dá)，陽性表達(dá)細(xì)胞達(dá)98％；
　　2、蘇木素-伊紅染色（HE染色）結(jié)果顯示rM1/2和/或病毒干預(yù)小鼠氣管上皮細(xì)胞4h、24h，可見細(xì)胞變性，胞漿中出現(xiàn)大小不一的空泡,部分細(xì)胞出現(xiàn)核固縮、核溶解等壞死病理改變；
　　3、RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，rM1組和rM2組較正常組的Mbd3、Mbd4、IFN-γ基因表

4、達(dá)上調(diào)（p<0.05）；與病毒組比較，rM1聯(lián)合病毒組和rM2聯(lián)合病毒組Mbd3、Mbd4、IFN-γ基因表達(dá)上調(diào)（p<0.05）；各組間p38、ERK、JNK基因表達(dá)水平無明顯變化;
　　4、Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常組相比，rM1和rM2組IFN-γ蛋白表達(dá)上調(diào)（p<0.05）；與病毒組比較，rM1聯(lián)合病毒和rM2聯(lián)合病毒組IFN-γ蛋白表達(dá)上調(diào)（p<0.05）；rM1/2組較正常組、rM1/2聯(lián)合病毒組較病

5、毒組磷酸化p38、磷酸化JNK表達(dá)水平均增加（p<0.05），24h磷酸化ERK與IFN-γ表達(dá)水平一致，各組間總p38、總ERK、總JNK蛋白表達(dá)水平無明顯變化；
　　5、ELISA結(jié)果表明：與正常組比較，rM1和rM2組MBD3、MBD4蛋白表達(dá)上調(diào)（p<0.05），與病毒組比較，rM1/2聯(lián)合病毒MBD3、MBD4蛋白表達(dá)上調(diào)（p<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、甲型流感病毒可通過激活MAPKs信號通路誘導(dǎo)小鼠