FGF2在甲型H1N1流感病毒感染肺損傷中的作用機(jī)制研究.pdf

1、甲型H1N1流感病毒感染人體能夠造成嚴(yán)重的急性肺損傷，具有較高的發(fā)病率和致死率。甲流感染伴有多種細(xì)胞因子水平升高，這些因子在肺損傷中的作用機(jī)制也陸續(xù)被揭示。有研究發(fā)現(xiàn)，在多個(gè)組織損傷和炎癥模型中均檢測到有FGF2細(xì)胞因子水平升高，然而目前關(guān)于FGF2在流感誘導(dǎo)的急性肺損傷中的作用機(jī)制還未曾有報(bào)道。FGF2是一個(gè)多效性的細(xì)胞因子，不僅能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖、血管生成，而且參與組織損傷修復(fù)，誘導(dǎo)胚胎發(fā)育等多種生物學(xué)過程。本研究試圖探究FGF2在甲

2、型H1N1流感病毒感染引起的急性肺損傷中的作用機(jī)制。
　　首先分析了甲型H1N1流感患者體內(nèi)以及甲型H1N1流感病毒(A/Beijing/501/2009)感染致小鼠肺損傷模型中FGF2分子的表達(dá)水平，結(jié)果表明甲流患者血清中FGF2水平顯著高于正常人群，在小鼠肺泡灌洗液中FGF2的水平呈顯著上升趨勢。A/Beijing/501/2009感染致小鼠肺損傷模型中，用FGF2中和抗體干預(yù)后，發(fā)現(xiàn)小鼠肺損傷更為嚴(yán)重，體重和存活率下降，其中

3、早期抗體干預(yù)比晚期干預(yù)小鼠發(fā)病更為嚴(yán)重。同樣的，F(xiàn)GF2缺陷小鼠表現(xiàn)出對A/Beijing/501/2009以及A/Puerto Rico/8/1934流感病毒更為易感，小鼠肺損傷更重、死亡率更高。相反，用FGF2重組蛋白給藥后，小鼠病情減輕，存活率明顯上升。以上這些結(jié)果表明，F(xiàn)GF2在甲型H1N1流感病毒誘導(dǎo)的急性肺損傷中起保護(hù)作用。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF2缺陷小鼠感染甲型H1N1流感病毒后，早期肺泡灌洗液中炎性細(xì)胞的募集量明顯少于野

4、生型小鼠，其中主要以中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞為主。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，在FGF2缺陷小鼠肺泡灌洗液中，多種細(xì)胞因子水平顯著低于野生型小鼠，綜合表現(xiàn)出FGF2敲除后不能激發(fā)有效的保護(hù)性炎癥應(yīng)答。以上結(jié)果預(yù)示著FGF2敲除后這些有差異的炎性細(xì)胞和細(xì)胞因子可能在流感感染致小鼠死亡的早期發(fā)揮著重要的保護(hù)功能。此外，在FGF2缺陷小鼠肺組織中檢測到較高的病毒載量，而FGF2給藥治療能夠降低小鼠肺部病毒載量。最后，我們還發(fā)現(xiàn)FGF2主要分泌細(xì)胞來源是肺上皮細(xì)胞

5、，而非中性粒細(xì)胞或者巨噬細(xì)胞。進(jìn)一步研究FGF2介導(dǎo)的肺損傷中下游信號通路發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF2極有可能參與了P38介導(dǎo)的MAPK信號通路，預(yù)示著該信號通路的激活很可能在保護(hù)小鼠感染緩解肺損傷中發(fā)揮重要作用。
　　近年來，關(guān)于miRNA和炎癥應(yīng)答關(guān)系的研究已經(jīng)成為感染免疫中研究的熱點(diǎn)，但目前對于miRNA在甲型H1N1流感病毒感染中的作用機(jī)制仍然知之甚少。是否存在關(guān)鍵的miRNA在甲型H1N1流感病毒感染中發(fā)揮重要功能還不得而知。通過檢測

6、甲型H1N1流感病毒感染誘導(dǎo)miRNA的表達(dá)水平，我們發(fā)現(xiàn)甲型H1N1流感病毒感染能夠造成miRNAs表達(dá)紊亂。將表達(dá)顯著下調(diào)的miRNA對FGF2靶基因進(jìn)行預(yù)測，篩選并驗(yàn)證了能夠顯著抑制FGF2基因表達(dá)的miRNA，包括miR-194-5p、miR-25-3p、miR-92b-3p、miR-361-5p、miR-15b-5p、miR-22-3p、miR-17-5p、miR-503-5p和miR-16-5p。進(jìn)一步驗(yàn)證抑制倍數(shù)在2倍以上

7、的miRNA對FGF23'UTR的作用，我們構(gòu)建了6個(gè)FGF23'UTR短片段，分別檢測了對應(yīng)miRNA的作用，同時(shí)我們也構(gòu)建了每個(gè)miRNA在3'UTR上對應(yīng)的突變質(zhì)粒，找到了miRNA與FGF23'UTR的具體結(jié)合位點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)miR-194-5p、miR-361-5p、miR-92b-3p、miR-25a-3p、miR-16-5p、miR-15a-5p、miR-15b-5p和miR-503-5p這8個(gè)miRNA與FGF23'UTR

8、有直接的作用，而作用位點(diǎn)即每個(gè)miRNA對應(yīng)的3'UTR上突變的位點(diǎn)。此外，在細(xì)胞和小鼠模型中驗(yàn)證了這些miRNA的表達(dá)水平，并且驗(yàn)證了這些miRNA的功能，找到了關(guān)鍵的miRNA調(diào)節(jié)FGF2介導(dǎo)的肺損傷保護(hù)過程，而miRNA的拮抗劑又能夠治療流感感染引起的小鼠肺損傷，因此，研究miRNA也為甲型H1N1流感病毒感染造成急性肺損傷的治療提供了新的研究方向。
　　分泌型FGF2與細(xì)胞表面高親和力受體(FGFR)結(jié)合后，能夠促進(jìn)受體二

9、聚化，激活胞內(nèi)酪氨酸激酶活性，導(dǎo)致下游多條信號通路的活化。FGFR包括FGFR1-4四個(gè)成員，屬于酪氨酸激酶受體亞家族。有研究發(fā)現(xiàn)用廣譜酪氨酸激酶抑制劑能夠促進(jìn)流感病毒的復(fù)制，然而FGFR家族各成員是否也參與了流感病毒的復(fù)制還不是很清楚，它們是否參與了FGF2介導(dǎo)的肺損傷保護(hù)機(jī)制也有待研究。我們用甲型H1N1流感病毒（PR8和H5N1）感染人肺上皮細(xì)胞A549，檢測了四種受體成員的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)FGFR1和FGFR4表達(dá)豐度較高，而FG

10、FR2和FGFR3表達(dá)相對較少，病毒感染后造成FGFR1和FGFR4表達(dá)顯著下調(diào)。進(jìn)一步用siRNA介導(dǎo)的基因表達(dá)沉默，確定了FGFR1敲除能夠顯著促進(jìn)甲型流感病毒的復(fù)制，而FGFR4卻沒有該效應(yīng)。相反，由慢病毒介導(dǎo)的FGFR1過表達(dá)能夠抑制流感病毒復(fù)制，而FGFR4不具有該效應(yīng)。另外，PR8感染不僅能夠下調(diào)FGFR1蛋白水平，而且能夠下調(diào)其磷酸化水平。用FGFR1選擇性抑制劑PD173074能夠明顯促進(jìn)流感病毒的復(fù)制，說明FGFR1激