腎母細胞瘤血清及瘤體組織剔除炎癥因子干擾后標記物的篩選、鑒定及驗證.pdf

1、研究背景與研究目的:
　　腎母細胞瘤是小兒泌尿系統(tǒng)最常見的惡性實體腫瘤。腎母細胞瘤是原發(fā)性腎臟惡性腫瘤，由于一些原始的腎胚胎細胞在發(fā)生的進程中出現(xiàn)了基因調控的異常，進而使細胞分化成熟出現(xiàn)障礙，導致了細胞異常增殖分裂而不受控制。在腎母細胞瘤細胞中，經?？梢钥吹皆嫉哪I小管和腎小球。大約75％的病例發(fā)生在5歲以內的兒童，尤其多見于2～4歲的幼兒。腎母細胞瘤約93%為單側發(fā)病，大約10％的患兒為雙側發(fā)病，左右兩側的發(fā)病率大致相近，同時或

2、者相繼發(fā)生。發(fā)病率在男女性別上幾乎沒有差異，但是在大部分的病例報告中，男性患者發(fā)病率稍多于女性，也有極少病例發(fā)生于成人。腎母細胞瘤瘤體體積比較大，邊界分布清楚，部分腫瘤也可有假膜形成。腎母細胞瘤的切面顏色灰白，切面多呈爛魚肉樣，腫瘤質地比較柔軟，大部分伴有出血和壞死等，也可見骨樣組織的出現(xiàn)。目前早期診斷、病理分型以及恰當?shù)闹委煼绞绞怯绊懟純侯A后的主要因素。目前，腎母細胞瘤的診斷主要依據(jù)患兒的臨床表現(xiàn)結合超聲，靜脈尿路照影，CT等手段。對

3、于腎母細胞瘤I或II期的患兒，主要還是以手術治療或化療為主；而對于晚期病例則需要擴大治療，輔以化療，甚至放療。多數(shù)病例雖然得以確診，卻因不能早期診斷，貽誤最佳治療時機而影響預后。
　　目前，隨著蛋白質組學技術的日趨成熟，為惡性腫瘤的相關研究提供了新的思路。如今應用最廣泛的蛋白組學技術是表面增強激光解吸電離飛行時間質譜(SELDI-TOF-MS)技術，蛋白質芯片的應用是其核心技術，它的主要特點就是可以從生物和臨床樣品中快速提供蛋白質

4、表達譜的能力。腫瘤標志物既能夠作為患者早期診斷的有力證據(jù)，又能夠作為后期療效的監(jiān)測指標。在本課題組前期的研究過程中，我們已經通過蛋白質組學技術篩選和鑒定了腎母細胞瘤血清中的腫瘤標志物，但是，腎母細胞瘤瘤體組織中是否存在與血清中類似的蛋白質標記物尚不清楚。另外，在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展的各個階段，炎癥也起到一定的推動作用，在腫瘤患者的血清中，可以檢測到某些炎癥因子的參與，其可能干擾腫瘤的診斷和監(jiān)測。所以，在篩選和鑒定腫瘤標志物過程中，有必要剔除

5、炎癥因子的干擾。
　　另外僅僅排除和腫瘤相關的炎癥因子也不足以排除炎癥因子的干擾，本研究選取SIRS患兒血清作為對照組，擴大剔除的炎癥因子范圍。全身炎癥反應綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）：是因為機體受到感染或非感染的病因，導致機體自我持續(xù)放大和自我破壞的而失控的全身性炎癥反應。全身炎癥反應綜合征是機體在修復和生存的過程中出現(xiàn)過度的應激反應的一種臨床過程。與此同時，

6、機體和組織會釋放大量的炎性介質和細胞因子，在病人的血液循環(huán)中早期可以發(fā)現(xiàn)如IL-1，TNF，MIP；接著會發(fā)現(xiàn)許多細胞因子，中性細胞脫顆粒物，補體片段，花生四烯酸衍生物，還有多種趨化因子。
　　本研究運用蛋白質組學的表面增強激光解吸電離飛行時間質譜(SELDI-TOF-MS)技術檢測腎母細胞瘤患兒血清，健康對照組血清，同時與重癥感染患兒對照組血清進行對比，最大程度剔除炎癥因子的干擾，篩選出特異的蛋白質標記物，運用高效液相色譜技術（

7、HPLC）和基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜技術（MALDI-TOF-MS）對目標蛋白進行純化，并用二維液相色譜-線性離子阱質譜（2D-LC-LTQ-MS）聯(lián)用系統(tǒng)技術對篩選出的特異的蛋白質標記物進行鑒定，以期與前期的研究結果相契合。同時，為了驗證在腎母細胞瘤瘤體組織中是否存在相似的非炎癥性蛋白質標記物，本研究通過表面增強激光解吸電離飛行時間質譜(SELDI-TOF-MS)技術檢測腎母細胞瘤患兒瘤體組織總蛋白，正常腎組織總蛋白，同時與重

8、癥感染患兒對照組血清進行對比，剔除炎癥因子的干擾，篩選出特異的蛋白質標記物，運用聚丙烯酰胺凝膠電泳（TRICINE-SDS-PAGE）技術對目標蛋白進行純化，收集目標蛋白。利用基質輔助激光解吸電離串聯(lián)飛行時間質譜（MALDI-TOF/TOF）技術鑒定目標蛋白。所以，本研究的目的就是最大程度排除炎癥因子的干擾，篩選和鑒定腎母細胞瘤血清及其瘤體組織中特異性蛋白質標記物。
　　材料與方法:
　　2.1實驗材料
　　2.1.1

9、臨床病例資料
　　本研究收集170例血清和85例組織標本均從鄭州大學第一附屬醫(yī)院獲得。其中腎母細胞瘤組血清50例，平均年齡2.9±0.1歲，男性28例，女性22例；正常對照組血清60例，平均年齡3.2±0.1歲，男性34例，女性26例；SIRS對照組60例，平均年齡3.1±0.1歲，男性37例，女性23例。外周靜脈血標本均抽取于患兒清晨空腹時，室溫下靜置1h，3000r/min離心10min，收集血清樣本，儲存于-80℃冰箱，保存

10、備用。收集鄭州大學第一附屬醫(yī)院2011年至2013年腎母細胞瘤患兒術后瘤體組織45例，其中男性23例，女性22例，平均年齡2.8±0.1歲。收集患兒癌旁正常腎組織40例（根治性手術31例，姑息性切除9例）作為正常對照組，男性22例，女性18例，平均年齡2.9±0.1歲。正常對照組，SIRS對照組與腎母細胞瘤組年齡、性別相匹配。相關結果得到2位以上的病理學專家證實經手術及組織穿刺活檢病理診斷為腎母細胞瘤。收集的組織樣本，儲存于-80℃冰箱

11、，保存?zhèn)溆?。本實驗經倫理委員會同意，且受試者均簽署有知情同意書。
　　2.1.2主要試劑及儀器
　　尿素、NaAC、芥子酸(SPA)、二硫蘇糖醇(DTT)、3-[3-(膽酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸內鹽(CHAPS)和胰蛋白酶均來自美國Promega公司。SELDI-TOF-MS、Ciphergen PBS II和WCX2蛋白質芯片均來自美國Ciphergen公司。胰島素、細胞色素C、碘乙酰胺(IAM)、乙腈、α-氰基-4-羥

12、基肉桂酸(CHCA)、NH4HCO均來自美國Sigma公司。RNeasy Plus Micro Kit試劑盒、RNAprep pure Tissue Kit購自北京Qiagen公司。
　　PBS II+型SELDI-TOF-MS和Bio-processor：弱陽離子交換芯片（WCX2）蛋白質芯片工作平臺均來自于美國CiphergenBiosystem公司；HPLC來自于日本Shimadzu公司，其中C18（250*4.6mm）色譜

13、柱來自于德國Sunchrom公司；MALDI-TOF/TOF-MS系統(tǒng)來自于德國BioRad公司；2D-LC-LTQ-MS系統(tǒng)來自于美國Thermo Electron公司。
　　2.2實驗方法
　　2.2.1組織總蛋白的提取
　　以下操作均在冰上進行：1.將低溫保存的組織樣本進行稱重。2.加入細胞裂解液。組織樣本與細胞裂解液比例一般為100mg：500μl，然后加入蛋白酶抑制劑2ul。3.用組織勻漿器把腫瘤組織勻漿，至

14、無明顯肉眼可見固體。4.將組織勻漿吸入另外一個預冷的干凈離心管內，4℃14000g/min離心25~30mins。5.最后將上清液轉移到另一預冷的干凈離心管，即可得到總蛋白。上述蛋白提取物分裝后，標記清楚于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br>　　2.2.2腎母細胞瘤血清及其瘤體組織中蛋白質的篩選
　　冰浴中解凍血清和瘤體組織總蛋白標本，在4℃下10000r/min離心2min。將96孔板放置于冰盒上，然后，每孔加入5μl血清和瘤體組織總

15、蛋白樣本，U9(9mol/L尿素)，1%Bar，2%CHAPS10μl，在4℃層析柜中600r/min振蕩30min。在震蕩結束前留15 min進行蛋白質芯片的預處理，將蛋白質芯片裝入Bioprocessor加樣器中，記錄下蛋白質芯片的號碼，每孔加入NaAC(100mmol/L，pH4)200μl，放入層析柜中600r/min振蕩2min，重復以上操作1次。經過U9處理后的96孔板置于冰盒上，用排槍加入NaAC185μl，層析柜中4℃6

16、00r/min震蕩2min。取已處理的樣本100μl加到蛋白質芯片上，置于層析柜中4℃600r/min結合1h，甩去殘液，快速拍干。然后加入NaAC200μl，600r/min振蕩5min后，甩去殘液，快速拍干，重復操作3次。接著用去離子水200μl沖洗各孔2次，甩干殘液。待蛋白質芯片風干后，每孔加入50%飽和的SPA1μl，分兩次完成，干燥后即可上機待檢測。
　　2.2.3數(shù)據(jù)分析及統(tǒng)計學處理
　　質譜分析的原始數(shù)據(jù)先經過

17、濾噪音和聚類分析處理，將初步篩選出的質荷比峰值數(shù)據(jù)做Wilconxon秩和檢驗。初步篩選出的m/z峰值是分析數(shù)據(jù)的對像，隨后，需要將不同組別間的質譜檢測數(shù)據(jù)進行t檢驗。檢驗標準取α=0.01；腎母細胞瘤術前血清組、正常對照組血清、瘤體組織組、正常腎組織組及SIRS對照組血清間的差異性峰值進行分析比對，找出兩組差異性蛋白峰值相同的差異性蛋白（數(shù)據(jù)結果存在0.3%偏差），即聚類分析。其既與正常對照組存在特異性，又與炎性對照組存在特異性，再提

18、出與15種與腫瘤相關的炎性因子，這樣就在最大程度上排除了炎癥因子對于篩選腎母細胞瘤特異性蛋白質標記物的干擾。
　　2.2.4腎母細胞瘤血清非炎癥性標記物的純化
　　在實驗前取出凍存于-80℃冰箱中的分裝的血清樣品，放置于冰盒上慢慢解凍。吸取血清樣品100μl，加入去離子水300μl和乙腈600μl，充分振蕩混勻后，放置于4℃下，以便使血清中的大分子蛋白得到充分沉淀。等待30min后取出樣品，在4℃的環(huán)境中，在10000rpm

19、的轉速下離心30min。丟棄沉淀，收集上清液，將液體真空干燥濃縮至體積小于50μl，然后加入H2O/0.1%TFA450μl，充分振蕩混勻后，用自行裝填的C18固相萃取小柱對其進行脫鹽。
　　采用C18反相高壓液相色譜柱對經上述處理后的血清樣品進行分離。H2O/0.1%TFA為流動相A，ACN/0.09% TFA為流動相B。加注樣品前，先用流動相B對色譜柱進行活化15min，再用流動相A對柱體平衡30min，然后通過自動進樣器上樣

20、。洗脫步驟為：100%流動相A和20-40%流動相B梯度各15min，40-70%流動相B梯度為50min，用100%流動相B沖洗柱體10min。整個過程中流速設置為0.5 ml/min，檢測波長設置為214nm、254nm和280nm。用離心管分別收集各峰組分，記錄好時間和順序，將收集樣品真空濃縮至體積小于20μl。對初步分離后的血清樣品和HPLC分離所得各組分進行MALDI-TOF-MS的線性模式檢測。
　　2.2.5腎母細胞

21、瘤瘤體組織非炎癥性蛋白標記物的純化
　　選取0.75mm的制膠玻璃，使下端邊緣對齊，用配套的玻璃夾夾緊，然后放置膠架上，將玻璃的下端與膠墊充分接觸，防止加入的制膠液體發(fā)生泄漏。先配制的分離膠加入至玻璃的2/3，再加入異丙醇使液面水平，靜置約1.0h-1.5h，待其凝固后吸干異丙醇，再加入配制的濃縮膠，選用配套的梳子小心插入，防止氣泡產生，再次靜置大約1.0h，等待膠體凝固，然后放入電泳槽，加入配制的電泳液，小心拔出梳子，準備加入樣

22、品。把前期去除大分子蛋白并濃縮后的組織總蛋白質樣本加入指示劑5ul，在沸水中煮沸樣品10min，取出后再次5000r/min離心5min。取10ul上清液小心加至膠體梳子的齒槽中，第一泳道加入Marker，對應相應的蛋白質分子量，作為觀察標尺，后面的泳道依次加入蛋白質樣本，且應詳細記錄。然后連接電泳儀，準確正負極。在濃縮膠時，電壓設定為30v，當指示劑接近至濃縮膠與分離膠交界處時，將電壓調到90v。大約5h小時后，指示劑接近分離膠膠體底

23、部時，關掉電泳儀，取出玻璃，小心分離濃縮膠和分離膠，防止破裂，把濃縮膠小心切除。然后，小心分離分離膠，放置到清潔的托盤中，倒入考馬斯亮藍染色劑，震蕩過夜，進行染色。染色結束后，用去離子水清洗干凈，再加入脫色液，震蕩4-6小時進行脫色，等待膠體顏色完全脫凈后，再用去離子水清洗干凈，最后在膠體上顯示出目標藍色條帶。將膠體放置超凈工作臺，帶上無菌口罩、帽子及手套，小心切下目標蛋白質目標條帶，并將條帶切碎，分裝至不同EP管，做好標記，分別記錄具

24、體蛋白質條帶信息，整個過程務必保證在冰面上進行。然后對顯示的目標條帶進行MALDI-TOF-MS檢測，最終確定膠體上目標條帶。
　　2.2.6腎母細胞瘤血清非炎癥性蛋白標記物的鑒定
　　取對應的目標蛋白質樣品20μl，然后加入60μl8M尿素，使其最終濃度為6M，室溫振蕩20min使其充分溶解；再加入0.8μl1M DTT，使其最終濃度為10mM，室溫放置1h；然后加入3.2μl1M IAM，使其最終濃度為40mM，避光放置

25、45min；再加入3.2μl1M DTT，使其最終濃度為40mM，室溫放置30min；最后加入400μl50 mM NH4HCO3以稀釋樣品，將尿素最終濃度降到1M，pH值控制到大約為8.0。每份樣品中加入胰酶0.08μg，于37℃水浴下酶解過夜，然后加入0.2%TFA溶液，使樣品溶液pH值下降至6.0以下，以終止樣品酶解反應。然后以12000g離心樣品溶液10min，吸取上清液，使其真空濃縮至體積小于10μl，再將樣品加入到C18蛋白

26、質樣品檢測的梯度洗脫柱中。將2D-LC-LTQ-MS系統(tǒng)的噴霧系統(tǒng)與加樣后的樣品柱和梯度洗脫柱相串聯(lián)，進行肽質荷比圖譜的檢測。最后，將檢測結果錄入SEQUEST檢索程序，在Bioworks數(shù)據(jù)庫檢索與檢測結果肽段及氨基酸相匹配的可能蛋白質。
　　2.2.7腎母細胞瘤瘤體組織非炎癥性蛋白標記物的鑒定
　　在對應EP管中加入wash buffer80ul，37℃震蕩蛋白質樣品20min，吸取洗脫液，加入新的wash buffer

27、，重復操作三次，直到膠體的藍色洗去，接近白色透明狀。然后將膠體放入振蕩器，溫度升至90℃，膠體干燥15min。然后加入Digest Buffer20ul和稀釋的Reducing agent2 ul，將其充分混勻。然后，37℃水浴10 min。離開水浴后，使其溫度自然降至室溫，加入Blocking agent2ul，充分混勻。在室溫中靜置10min。然后加入稀釋的胰蛋白酶0.5ul，充分混勻，使最終胰蛋白酶的濃度達到8ng/ul。務必確保

28、使膠體完全沉浸在液體中，5000r/min離心5min。37℃振蕩12-14h過夜。最后，放入離心機，10000r/min離心10-15min，小心將上清液移至新的EP管中，同時在管壁上做好標記，書面記錄。
　　在蛋白芯片板靶環(huán)上加入1ul酶解樣本，室溫干燥后加入1ul基質，先對MALDI-TOF/TOF經過校正后，然后經激光解吸電離，收集到相應的肽段質譜數(shù)據(jù)，通過Mascot搜索軟件，再與Swissprot數(shù)據(jù)庫連接，搜索相匹配

29、的蛋白質。
　　2.2.8 RT-PCR驗證腎母細胞瘤瘤體組織非炎癥性蛋白標記物在組織中的基因表達
　　使用RNAprep pure Tissue Kit提取腫瘤組和正常組組織中的RNA，使用Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit以RNA為模板合成first-strand cDNA。在Real-time PCR過程中使用Scientific Maxima SYBR Green q

30、PCR Master Mixes檢測腫瘤組和正常組的first-strand cDNA擴增情況，分析目標蛋白質的表達。PCR過程中目標蛋白Profilin-1的引物：Forward5′-ACGCCTACATCGACAACCTC-3′；Reverse5′-TGATGTTGACGAACGTTTTCC-3′。PCR過程中目標蛋白Ubiquitin的引物：Forward5'-GTCACTAAGCCATCGGTCGT-3'；Reverse5'-A

31、CACGGACA CAACCAGTTCA-3'。PCR反應使用兩步法：50℃ UDG預處理2min，95℃預變性10min；擴增40個循環(huán)，每個循環(huán)的組成為95℃變性15sec、60℃引物退火30sec、72℃引物延伸30sec。使用Molecular Analyst software軟件分析PCR聚合物，使用標準化計算目標蛋白基因對于β-actin的比值。
　　2.2.9 ELISA驗證腎母細胞瘤血清非炎癥性蛋白標記物在血清中的

32、表達
　　使用Enzyme Linked-Immuno-Sorbent Assay（ELISA）檢測腫瘤組血清和正常組血清中的APOC-I蛋白質表達情況。首先配制0pg/ml，62.5pg/ml，125pg/ml，250pg/ml，500pg/ml，1000pg/ml，2000pg/ml和4000 pg/ml的APOC-I凍干標準品各100μL，然后加入預包被抗人APOC-I抗體的96孔板中，設置3個復孔；腫瘤組血清和正常組血清蛋

33、白樣品各取10個，稀釋100倍后，每孔按100μL加入預包被抗人APOC-I抗體的96孔板中，設置3個復孔，孵育酶標板。吸去各孔液體后，加入100μL生物素標記的抗人APOC-I抗體，孵育酶標板；洗板后，加入ABC工作液，孵育酶標板；洗板后，每孔加入TMB顯色液90μL，孵育后每孔加入TMB終止液100μL終止顯色反應。酶標儀調整到450nm，讀出各孔吸光值，根據(jù)標準品的吸光值繪制出標準曲線，計算待測樣品的濃度。
　　2.2.10

34、 ELISA驗證腎母細胞瘤體組織非炎癥性蛋白標記物在組織中的表達
　　使用Enzyme Linked-Immuno-Sorbent Assay（ELISA）檢測腫瘤組和正常組組織中的Ubiquitin和Profilin-1蛋白質表達情況。首先配制0pg/ml，62.5pg/ml，125pg/ml，250pg/ml，500pg/ml，1000pg/ml，2000pg/ml和4000 pg/ml的Ubiquitin和Profilin-

35、1凍干標準品各100μL加入預包被抗人Ubiquitin和Profilin-1抗體的96孔板中，設置3個復孔；腫瘤組和正常組組織總蛋白樣品各取10個，稀釋100倍后，每孔按100μL加入預包被抗人Ubiquitin和Profilin-1抗體的96孔板中，設置3個復孔，孵育酶標板。吸去各孔液體后，加入100μL生物素標記的抗人Ubiquitin和Profilin-1抗體，孵育酶標板；洗板后，加入ABC工作液，孵育酶標板；洗板后，每孔加入T

36、MB顯色液90μL，孵育后每孔加入TMB終止液100μL終止顯色反應。酶標儀調整到450nm，讀出各孔吸光值，根據(jù)標準品的吸光值繪制出標準曲線，計算待測樣品的濃度。
　　結果:
　　3.1腎母細胞瘤血清標記物的篩選
　　通過SELDI-TOF-MS對預處理的腎母細胞瘤患兒血清、健康對照組血清和重癥感染患兒血清檢測后，得到一系列蛋白質峰值數(shù)據(jù)和炎癥因子峰值及其分解的肽段峰值。這些蛋白質峰值數(shù)據(jù)按照病例組、正常對照組及炎癥

37、對照組進行Wilcoxon秩和檢驗(P＜0.01)，將差異性蛋白質峰值篩選出來。其中：病例組血清與正常對照組血清中篩選出37個差異性蛋白質峰值，35個蛋白質峰值在正常對照組中高表達，2個蛋白質峰值在病例組中高表達；病例組血清與炎癥對照組血清中篩選出27個差異性蛋白質峰值。將以上兩組差異性蛋白進行對比，找出兩組差異性蛋白峰值相同的差異性蛋白（數(shù)據(jù)結果存在0.3%偏差），篩出m/z位于6438Da的蛋白質或肽段。其既與正常對照組存在特異性，

38、又與炎性對照組存在特異性，再提出與15種與腫瘤相關的炎性因子，在最大程度上排除了炎癥因子對篩選腎母細胞瘤特異性蛋白質標記物的干擾，確定了腎母細胞瘤非炎癥性蛋白質標記物的m/z為6438Da。
　　3.2腎母細胞瘤瘤體組織標記物的篩選
　　通過SELDI-TOF-MS預處理的腎母細胞瘤腫瘤組組織蛋白、正常對照組蛋白檢測后，得到一系列蛋白質峰值數(shù)據(jù)及其分解的肽段峰值。這些蛋白質峰值數(shù)據(jù)按照腫瘤組、正常對照組進行Wilcoxon秩

39、和檢驗(P＜0.01)，將差異性蛋白質峰值篩選出來。其中，腫瘤組與正常對照組中篩選出50個差異性蛋白質峰值，21個蛋白質峰值在正常對照組中高表達，29個蛋白質峰值在腫瘤組中高表達；腫瘤組組與炎癥對照組中篩選出50個差異性蛋白質峰值。將以上兩組差異性蛋白進行對比，找出兩組差異性蛋白峰值相同的差異性蛋白（數(shù)據(jù)結果存在0.3%偏差），篩出m/z位于8350Da和5363Da的蛋白質或肽段。其既與正常對照組存在特異性，又與炎性對照組存在特異性，

40、再提出與15種與腫瘤相關的炎性因子，在最大程度上排除了炎癥因子對篩選腎母細胞瘤特異性蛋白質標記物的干擾，得到m/z峰位于8350Da和5363Da蛋白質標記物兩個。
　　3.3腎母細胞瘤血清非炎癥性標記物的純化及鑒定
　　應用HPLC法分離純化病例組血清樣本中的m/z為6438Da的特異性標記物蛋白，同時將HPLC法得到的不同峰值的蛋白質及肽段分裝并進行MALDI-TOF-MS檢測，根據(jù)MALDI-TOF-MS蛋白質質譜圖找

41、出m/z為6438Da(SELDI-TOF-MS結果存在0.3%的差異)蛋白質或肽段樣品。
　　將檢測出的m/z為6438Da的蛋白質或肽段樣品分別酶解及通過2D-LC-LTQ-MS系統(tǒng)檢測肽段。m/z為6438 Da的蛋白質或肽段其序列為：E.LK EFGNTLEDKA RELISRIKQS ELSAKMREWF SETFQKVKEK.G，通過將肽段導入SEQUEST檢索程序并在Bioworks數(shù)據(jù)庫檢索，此肽段為載脂蛋白C-I

42、(apolipoprotein C-I, APO C-I)的一個肽段。最后利用SEQUEST檢索程序統(tǒng)計兩種肽段在其鑒定的目標蛋白質中的覆蓋率。
　　3.4腎母細胞瘤瘤體組織非炎癥性標記物的純化及鑒定
　　通過聚丙烯酰胺凝膠電泳技術對目標蛋白進行分離純化，根據(jù)Marker提供的參照標尺，確定膠體上目標條帶（圖3）。同時將目標蛋白質及肽段進行MALDI-TOF-MS檢測，根據(jù)MALDI-TOF-MS蛋白質質譜圖(圖4)找出m/

43、z為5363Da和8350Da(SELDI-TOF-MS結果存在0.3%的差異)蛋白質或肽段樣品。
　　根據(jù)Marker提供的參照標尺，在對應的分子量上，切除目標條帶，酶解離心后，取上清液，利用MALDI-TOF/TOF平臺對得到肽段混合物并進行檢測。m/z為5363 Da的蛋白質或肽段其序列為：K.IQDKEGIPPDQQRLIFAGKQLEDGRTLS DYNIQKESTLHLVLRLR.G。通過將肽段導入Mascot檢索程序

44、并在Swissprot數(shù)據(jù)庫檢索，此肽段為泛素(Ubiquitin，UBIQ)的一個肽段。m/z為8350 Da的蛋白質或肽段其序列為：K.DSPSVWAAVPGKTFVNITPAEVGVLVGKDRSSFYVNGLTLGGQKCSVIRDSLLQDGEFSMDLRTKSTGGAPTFNVTVK.T。通過將肽段導入Mascot檢索程序并在Swissprot數(shù)據(jù)庫檢索，此肽段為前纖維蛋白-1(Profilin-1，PFN1)的一個肽段。<

45、br>　　3.5 ELISA驗證腎母細胞瘤血清非炎癥性蛋白標記物在血清中的表達
　　我們使用ELISA對腫瘤組血清和正常組血清中的APO C-I蛋白質的表達進行檢測。通過標準品的吸光值數(shù)據(jù)繪制出標準曲線，將待測樣品的吸光值帶入公式得到腫瘤組和正常組組織中的APO C-I蛋白質的濃度，結果表明APO C-I在腫瘤組中低表達，在正常組中高表達。
　　3.6 RT-PCR驗證腎母細胞瘤瘤體組織非炎癥性蛋白標記物在組織中的基因表達<

46、br>　　為了驗證MALDI-TOF-TOF鑒定的目標蛋白質就是Ubiquitin和Profilin-1，我們使用實時熒光定量PCR對Ubiquitin和Profilin-1基因進行檢測，通過Real-time PCR分析表明，Ubiquitin基因在腫瘤組組織中低表達，在正常組組織中高表達；Profilin-1基因在腫瘤組組織中高表達，在正常組組織中低表達。
　　3.7 ELISA驗證腎母細胞瘤體組織非炎癥性蛋白標記物在組織中的

47、表達
　　我們使用ELISA對腫瘤組和正常組組織中的Ubiquitin和Profilin-1蛋白質的表達進行檢測。通過標準品的吸光值數(shù)據(jù)繪制出標準曲線，將待測樣品的吸光值帶入公式得到腫瘤組和正常組組織中的Ubiquitin和Profilin-1蛋白質的濃度，結果表明Ubiquitin在腫瘤組組織中低表達，在正常組組織中高表達；Profilin-1在腫瘤組組織中高表達，在正常組組織中低表達。
　　結論:
　　通過本研究證

48、實了質荷比為6438Da的蛋白質或肽段為APO C-I，這種蛋白質的表達量在腎母細胞瘤患兒血清與正常組血清中均具有差異性，其結果與課題組前期的研究結果相契合；同時，本研究證實了質荷比5363Da和8350Da的蛋白質或肽段為泛素和前纖維蛋白-1，這兩種蛋白質的表達量在腎母細胞瘤患兒瘤體組織與正常組組織中均具有差異性，也證實了腎母細胞瘤血清與組織中沒有相同或相似的蛋白質標記物；并且在此次研究中最大程度的剔除了炎癥因子對尋找腎母細胞瘤蛋白質