鴉膽子苦醇對類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜細胞增殖、凋亡和運動能力調(diào)控的研究.pdf

1、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（ RA）是以滑膜炎為主要特征的慢性自身免疫性疾病，能夠侵犯全身各處的關(guān)節(jié)，呈現(xiàn)多發(fā)性和對稱性。RA的病理情況主要表現(xiàn)為滑膜增生、軟骨和骨的破壞、大量炎性細胞浸潤以及微血管的新生。RA能夠引起關(guān)節(jié)的疼痛和僵硬，甚至對關(guān)節(jié)進行嚴重的破壞。RA的病發(fā)原因復(fù)雜多樣并涉及淋巴細胞、滑膜細胞、軟骨細胞等多種細胞類型，其中類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細胞（ Rheumatoid arthritis fibroblast-like synov

2、iocytes, RA FLS）作為一種“類腫瘤樣”細胞，在 RA的發(fā)生和發(fā)展中起到了非常關(guān)鍵的作用。一方面，RA FLS的過度增殖和異常的凋亡能夠造成滑膜增厚，在炎癥反應(yīng)和關(guān)節(jié)破壞中發(fā)揮作用。另一方面，RA FLS表現(xiàn)出異常的遷移和侵襲能力，產(chǎn)生蛋白水解酶等對細胞外基質(zhì)（Extracellular matrix, ECM）進行降解并造成軟骨和骨的破壞進而導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形甚至關(guān)節(jié)功能喪失。鴉膽子苦醇（Brusatol）是近幾年腫瘤相關(guān)研究中

3、表現(xiàn)出良好抑癌作用的潛力藥物，其能夠有效地抑制腫瘤的形成和生長，具有良好的抗炎癥作用，并且在我國的中醫(yī)藥的運用中鴉膽子苦醇也取得了滿意的效果。作為“類腫瘤樣”細胞的RA FLS在其細胞學(xué)行為方面與腫瘤細胞有著相似的特點，因此在本課題中，我們把鴉膽子苦醇首次運用到RA的研究中，來探究鴉膽子苦醇對RA FLS的影響并進行相關(guān)機制的探索。
　　本研究主要內(nèi)容包括：①采用組織塊培養(yǎng)法分離提取RA FLS，采用結(jié)晶紫染色方法和細胞骨架染色方

4、法對細胞進行形態(tài)觀察，采用 Western blotting方法檢測細胞中 RA的標志物CHI3L1的表達情況。結(jié)果表明，細胞傳代至第3代便可得到形態(tài)均一的呈梭形的成纖維樣滑膜細胞（Fibroblast-like synoviocytes, FLS），并且卵圓形的細胞核位于細胞中央，細胞具有偽足結(jié)構(gòu)。與人正常成纖維樣滑膜細胞相比，分離提取的細胞中CHI3L1顯著性增加。提示采用組織塊培養(yǎng)法獲得了呈梭形的RA FLS。②采用MTS方法、E

5、dU方法和Western blotting方法檢測鴉膽子苦醇對RA FLS的毒性、增殖和凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3和Caspase-8的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在本課題中鴉膽子苦醇所采用的濃度范圍（0~80nM）內(nèi)，鴉膽子苦醇對RA FLS沒有毒性。鴉膽子苦醇能夠抑制RA FLS的增殖并且可以上調(diào)Caspase-3和Caspase-8的表達，促進RA FLS的凋亡。③采用Transwell細胞小室方法、細胞骨架染色方法和原子力顯微鏡（Ato

6、mic force microscope, AFM）方法檢測鴉膽子苦醇對細胞的遷移、侵襲、細胞骨架和細胞力學(xué)性質(zhì)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鴉膽子苦醇能夠抑制RA FLS的遷移和侵襲行為。鴉膽子苦醇能夠降低RA FLS板狀偽足和絲狀偽足的產(chǎn)生，降低RA FLS的運動能力。鴉膽子苦醇增加RA FLS的楊氏模量，提高細胞的硬度，降低細胞的變形和運動能力。④采用Western blotting方法、實時定量聚合酶鏈式反應(yīng)（Real-time quant

7、itative polymerase chain reaction， qPCR）方法、酶聯(lián)免疫吸附實驗（ Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）方法和酶譜方法檢測鴉膽子苦醇對與調(diào)控細胞的增殖、凋亡、遷移和侵襲等相關(guān)聯(lián)的轉(zhuǎn)錄因子Nrf2、pERK、CHI3L1、MMPs、N-WASP、肌動蛋白結(jié)合蛋白和整合素表達的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鴉膽子苦醇能夠上調(diào)Nrf2的表達，抑制ERK的磷酸化水平，下調(diào)CH