深海細(xì)菌Shewanella piezotolerans WP3中DMSO厭氧呼吸系統(tǒng)及其調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、細(xì)菌呼吸是自然界中一個(gè)最基本、最重要的生物代謝過(guò)程，具有很大靈活性和多樣性，各種呼吸途徑之間存在密切關(guān)系。細(xì)菌DMSO還原作用不僅參與了全球的硫元素、鐵元素的循環(huán)，還與全球氣候的降溫作用、雨水酸度、大氣臭氧濃度變化有密切關(guān)系。生活在深海環(huán)境下的極端微生物必然有特殊的生理代謝途徑適應(yīng)極端環(huán)境，在“全球生態(tài)系統(tǒng)”中扮演重要角色。 本文所研究的深海細(xì)菌分離自西太平洋1914米的深海沉積物中。菌種鑒定為Shewanella piezot

2、olerans WP3，它既是耐壓菌，又是低溫菌，現(xiàn)在已經(jīng)完成其全基因組序列的測(cè)定，是研究極端微生物適應(yīng)極端環(huán)境的理想材料。以WP3為實(shí)驗(yàn)材料，結(jié)合生物信息學(xué)、各種分子生物學(xué)手段，對(duì)其DMSO厭氧系統(tǒng)的組成、轉(zhuǎn)錄表達(dá)和調(diào)控進(jìn)行了一系列地分析，使我們對(duì)極端微生物獨(dú)特的基因類(lèi)型、特殊的代謝途徑以及在深海環(huán)境中的作用有了更為深入的了解。 希瓦氏細(xì)菌廣泛的分布在各種環(huán)境中，它們能夠?qū)MSO還原為DMS進(jìn)行厭氧生長(zhǎng)。通過(guò)對(duì)20株已完成全

3、基因組測(cè)序的希瓦氏細(xì)菌的dms基因簇的比較，在希瓦氏菌中已發(fā)現(xiàn)五種類(lèi)型的dms基因簇，其中10株具有typeⅠ dmsEFABGH。相比較于typeⅠ型的dms基因簇，typeⅡ型和typeⅢ型的則多含了一個(gè)編碼外膜脂蛋白的基因；typeⅣ型多含有一個(gè)不同的基因，編碼與核酸內(nèi)切酶相關(guān)的蛋白質(zhì)；typeⅤ型含有dmsC基因，其排序與E.coli中的很相似，缺少編碼DmsEF(類(lèi)似于MtrAB)的基因，DMSO還原酶位于細(xì)胞周質(zhì)，由DmsC

4、錨定在內(nèi)膜上[1]。 在WP3中，除了找到了希瓦氏菌中已發(fā)現(xiàn)的五種類(lèi)型之一的典型的dms基因簇類(lèi)型typeⅠ dmsEFABGH外，還發(fā)現(xiàn)一種新的類(lèi)型dms基因簇，即typeⅥ型dms基因簇，缺少dmsF基因，在dmsE與dmsA之間還存在兩個(gè)屬于LysR家族的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)基因，這兩個(gè)調(diào)節(jié)基因的功能還未知。WP3以DMSO進(jìn)行厭氧生長(zhǎng)時(shí)，typeⅥ型dms基因簇中的dmsA-2和dmsB-2明顯高表達(dá)，typeⅠ dmsEFABGH

5、也不是WP3進(jìn)行DMSO厭氧呼吸所必需的，與MR-1中的情況正好相反。 對(duì)成功構(gòu)建的dms基因單缺失突變株和雙dmsB基因缺失突變體在4℃和20℃下進(jìn)行表型生長(zhǎng)檢測(cè)，與野生菌株相比較，證明WP3中包含兩種具有還原DMSO的功能的不同類(lèi)型的dms基因簇。當(dāng)一種類(lèi)型的dms基因簇中DMSO還原酶基因缺失后，另一種類(lèi)型中DMSO還原酶基因就會(huì)增加轉(zhuǎn)錄量至原來(lái)的2-3倍，兩種類(lèi)型的基因簇的單獨(dú)存在均能維持缺失菌體最大限度的利用DMSO進(jìn)

6、行厭氧生長(zhǎng)，而與野生型WP3的厭氧生長(zhǎng)沒(méi)有什么差別。 WP3中DmsA經(jīng)NCBI Blaste比對(duì)，DmsA-1與Shewanella sediminis HAW-EB3有最高同源性90％，Shewanella woodyi ATCC51980有89％的同源性；DmsA-2與Shewanella putrefaciens CN32有最高同源性61％，與Shewanella oneidensis MR-1有60％的同源性。但是W

7、P3中的DmsA-1和DmsA-2在一級(jí)結(jié)構(gòu)的序列上相似性比較低，相比較其他菌株而言?xún)H有53％，在同一菌株中具有同樣的功能。WP3不僅含有兩種類(lèi)型的dms基因簇，而且DMSO還原酶復(fù)合物中蛋白質(zhì)的序列具有高度可變性，也很好的說(shuō)明了希瓦氏菌對(duì)DMSO還原作用的靈活多樣性。 在大腸桿菌中，F(xiàn)nr和NarL的共同作用調(diào)節(jié)dmsABC基因的表達(dá)。在厭氧條件下Fnr對(duì)dmsABC基因的表達(dá)起正調(diào)控作用；在硝酸鹽存在的條件下，NarL對(duì)dm

8、sABC基因的表達(dá)起負(fù)調(diào)控作用。在MR-1中，EtrA(電子傳遞蛋白A)與Fnr同源性高達(dá)73.6％，卻不是MR-1進(jìn)行DMSO厭氧呼吸所必需的，與Fnr的調(diào)控作用有很大不同。CRP在MR-1的厭氧呼吸中起到調(diào)控作用，MR-1的crp缺失突變體在以Fe(Ⅲ)、Mn(Ⅳ)、延胡索酸、硝酸鹽、DMSO為單一終末電子受體培養(yǎng)時(shí)不能進(jìn)行厭氧呼吸。厭氧條件下，CRP的激活機(jī)制還不清楚，CRP缺少明顯的感應(yīng)氧化還原勢(shì)的結(jié)構(gòu)，不被認(rèn)為可以感應(yīng)氧化還原

9、勢(shì)的變化。 現(xiàn)在WP3中crp基因缺失突變株正在構(gòu)建，所以crp基因與WP3厭氧呼吸是否有聯(lián)系還不確定。WP3中etrA基因(swp2580)與MR-1的同源性高達(dá)88％，已經(jīng)成功構(gòu)建了WP3中etrA基因的缺失突變體，測(cè)定了突變株△etrA對(duì)DMSO厭氧呼吸作用的影響。與野生型菌株比較，突變株的生長(zhǎng)狀態(tài)沒(méi)有什么變化，etrA對(duì)WP3還原DMSO的過(guò)程沒(méi)有調(diào)控作用。同時(shí)檢測(cè)了WP3中etrA基因?qū)蚧衔锏倪€原作用，在20℃下

10、以硫代硫酸鈉為電子受體進(jìn)行厭氧生長(zhǎng)時(shí)，突變株△etrA同樣能夠?qū)⒘虼蛩徕c還原，與野生菌株沒(méi)有差異。WP3中etrA基因?qū)ζ溥€原含硫化合物的過(guò)程并不起調(diào)控作用。 在研究fur基因(ferric uptake regulator)在WP3中的作用時(shí)，通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)fur基因缺失突變菌株的一些厭氧呼吸受到了很大的影響，這其中包括對(duì)DMSO的還原作用。在dms基因簇的附近沒(méi)有找到Fur的DNA結(jié)合區(qū)域，通過(guò)本實(shí)驗(yàn)室孫坪同學(xué)對(duì)fur基因的