金黃色葡萄球菌早期分泌系統(tǒng)外分泌蛋白A的分子克隆及免疫特征研究.pdf

1、目的：
　　金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是人類化膿性感染中最常見(jiàn)的致病菌。金黃色葡萄球菌主要通過(guò)產(chǎn)生多種毒力因子致病，常見(jiàn)的毒力因子包括腸毒素、溶血素、凝固酶、耐熱核酸酶、溶纖維蛋白酶、透明質(zhì)酸酶、殺白細(xì)胞素等。Es xA為金黃色葡萄球菌分泌的一個(gè)重要毒力因子，可以引起宿主膿腫的發(fā)生，另外 Es xA蛋白可通過(guò)易位子穿過(guò)宿主細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，逃避宿主機(jī)體免疫應(yīng)答，同時(shí)分泌或協(xié)同多種毒力因子引起宿主

2、細(xì)胞的溶解凋亡。本研究通過(guò)對(duì)金黃色葡萄球菌進(jìn)行 PCR擴(kuò)增目的 EsxA基因，構(gòu)建重組質(zhì)粒并進(jìn)行基因序列分析、蛋白的原核表達(dá)、純化；并檢測(cè)患者血清 EsxA特異性 IgG， IgG1，IgG2；構(gòu)建金黃色葡萄球菌感染小鼠模型，分離小鼠脾細(xì)胞，觀察其與EsxA蛋白體外共培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞因子IFN-γ、IL-4的水平變化，探討金葡感染中EsxA相關(guān)免疫特性，為其疫苗研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　根據(jù) GenBank中 EsxA的序列

3、，設(shè)計(jì)特異性引物，以臨床確診為金葡菌的DNA為模板PCR擴(kuò)增EsxA基因，PC R產(chǎn)物純化后用EcoRI、XhoI酶切，連接到pET-28a(+)載體，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)BL21（DE3），對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定和基因測(cè)序鑒定。用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白，His標(biāo)簽單克隆抗體進(jìn)行免疫印跡證實(shí)重組蛋白的表達(dá)。用His柱純化重組蛋白，Western blot分析其免疫原性。使用純化蛋白包被ELISA反應(yīng)板，檢測(cè)金黃色葡萄球菌感染患者血清Es

4、xA特異性IgG,IgG1及IgG2水平。構(gòu)建金黃色葡萄球菌感染的小鼠模型，取其脾細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，分別用EsxA蛋白及植物血凝素（PHA）刺激，檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液上清的IFN-γ，IL-4水平。
　　結(jié)果：
　　用臨床鑒定為MRSA的菌株基因組為模板，PCR擴(kuò)增EsxA基因，基因大小為294bp；重組的pET-28a-EsxA基因經(jīng)雙酶切鑒定可見(jiàn)目的片段，基因測(cè)序結(jié)果顯示EsxA在正確閱讀框內(nèi)，起始于ATG，終止于TAA，預(yù)測(cè)

5、分子量為11036.2，等電點(diǎn)為4.61?；蛲葱苑治鲲@示其與 GenBank報(bào)道的金黃色葡萄球菌2395 USA500株（菌株序列號(hào)為CP:007499.1）對(duì)比同源性達(dá)到99.6％。IPTG誘導(dǎo)后SDS-PAGE電泳，pET-28a(+)-EsxA/BL21在相應(yīng)分子量14.5kDa可見(jiàn)融合蛋白，免疫印跡可見(jiàn)目的蛋白。ElISA結(jié)果顯示金葡菌感染病人EsxA特異性IgG,IgG1， IgG2 OD值分別為（0.3286±0.293

6、）,（0.187±0.216），（0.161±0.207）。感染金葡菌兒童和健康兒童在血清EsxA特異性IgG抗體水平存在顯著差異(p<0.05)。IgG1、IgG2抗體水平也有差異，兩者具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)。小鼠感染后血清EsxA特異性IgG,IgG1，IgG2a OD值分別為（0.530±0.029），（0.1602±0.125），（0.314±0.117）。IgG，IgG2a水平存在顯著差異。脾細(xì)胞培養(yǎng)上清細(xì)胞因子IFN