雷公藤紅素抑制AR誘導前列腺癌細胞自噬的分子機制研究.pdf

1、前列腺癌是一種威脅男性健康的重大疾病，雄激素受體（Androgen Receptor，AR）信號通路在前列腺癌的發(fā)生與演進過程中發(fā)揮重要作用，因此，臨床上通過手術(shù)或藥物抑制AR信號通路是治療早期前列腺癌的標準方法。但是雄激素剝奪只能在一段時間內(nèi)延長患者的生存期，多數(shù)患者會在2年內(nèi)發(fā)生癌癥復發(fā)，發(fā)展為浸潤性更強的去勢抵抗性前列腺癌（Castration Resistant ProstateCancer，CRPC）。目前的研究結(jié)果顯示，去勢

2、抵抗的形成來源于 AR信號通路被重新激活。基于此，已經(jīng)有多種新型阻斷AR信號通路的藥物用于臨床。雷公藤紅素是從傳統(tǒng)中藥雷公藤根部分離的三萜烯類化合物，其化學結(jié)構(gòu)與第三代AR信號通路阻斷劑TOK-001相似，作用于AR降解途徑，對CRPC的治療具有潛在的應(yīng)用效果。
　　研究表明，抑制AR信號通路誘導細胞自噬。本研究首先分析了雷公藤紅素抑制AR信號通路對細胞自噬的誘導。qPCR顯示雷公藤紅素誘導ATG5和ATG7基因表達上調(diào)；共聚焦顯

3、微鏡觀察發(fā)現(xiàn)雷公藤紅素作用后自噬體與自噬斑數(shù)量增多；免疫印跡結(jié)果顯示雷公藤紅素處理后自噬標志物LC3-II/LC3-I比值升高，且自噬體受體蛋白p62表達降低，表明雷公藤紅素誘導細胞自噬的發(fā)生，并促進自噬潮的進行。在雷公藤紅素誘導細胞自噬過程中，伴隨著AR蛋白的降低，提示AR負調(diào)控雷公藤紅素誘導的細胞自噬。為進一步探究AR和雷公藤紅素誘導的細胞自噬的關(guān)系，本研究通過RNAi技術(shù)沉默AR，結(jié)果顯示AR沉默后細胞自噬水平升高；相反，過表達A

4、R或通過R1881激活內(nèi)源性AR則抑制基礎(chǔ)水平以及雷公藤紅素誘導的細胞自噬。這些結(jié)果表明，AR負調(diào)控雷公藤紅素誘導的細胞自噬。抑制AR信號通路將誘導細胞凋亡，而凋亡間接地誘導自噬的發(fā)生。為分析凋亡的間接影響，利用雄激素阻斷劑MDV3100抑制AR信號通路，證實在未發(fā)生凋亡的條件下，AR與自噬呈負相關(guān)。同樣，雷公藤紅素在不影響凋亡的條件下降低AR，導致細胞自噬。通過抑制劑處理進一步發(fā)現(xiàn)，凋亡被抑制不影響雷公藤紅素誘導的細胞自噬；而自噬被抑

5、制則促進細胞凋亡。
　　AR作為轉(zhuǎn)錄因子既可以調(diào)控功能基因的轉(zhuǎn)錄，也可以調(diào)控非編碼基因的轉(zhuǎn)錄。通過miRNA表達譜分析發(fā)現(xiàn)，雷公藤紅素誘導自噬過程中miR-101以及miR-17-92a基因簇的表達顯著下調(diào)，該結(jié)果通過qPCR得以驗證。鑒于miR-101以及miR-17-92a基因簇的啟動子區(qū)可以預測雄激素反應(yīng)元件（ARE），推測AR轉(zhuǎn)錄激活這兩個miRNAs抑制自噬。通過雙熒光素酶報告基因分析以及染色質(zhì)免疫沉淀證明AR能夠與mi

6、R-101和miR-17-92a基因簇預測的ARE結(jié)合。在前列腺癌細胞系，miR-101和miR-17-92a基因簇的表達與AR表達水平呈正相關(guān)。在AR陽性細胞沉默AR基因造成miR-101和miR-17-92a基因簇的表達下調(diào)；在AR陰性細胞過表達AR基因造成二者表達上調(diào)。這些結(jié)果進一步證實AR轉(zhuǎn)錄激活miR-101和miR-17-92a基因簇。
　　miR-101為自噬抑制劑。雷公藤紅素降低AR，解除了其對自噬的抑制，但轉(zhuǎn)染m

7、iR-101類似物可以彌補AR對自噬的抑制作用；過表達AR增強對自噬的抑制，但miR-101抑制劑共轉(zhuǎn)染可以逆轉(zhuǎn)AR高表達對自噬的抑制效應(yīng)，表明miR-101是AR抑制雷公藤紅素誘導的細胞自噬的一個效應(yīng)分子。
　　miR-17-92a基因簇與細胞自噬的調(diào)控關(guān)系未見報道，本研究通過蛋白免疫印跡實驗和共聚焦顯微鏡觀察，確認miR-17-92a基因簇抑制基礎(chǔ)水平以及雷公藤紅素誘導的細胞自噬。通過構(gòu)建miR-17-92a基因簇的截短體，解

8、析miR-17-92a基因簇成員分子與細胞自噬的關(guān)系，結(jié)果顯示在基因簇中miR-17和miR-20a能夠抑制基礎(chǔ)水平以及雷公藤紅素誘導的細胞自噬；而miR-18a則激活雷公藤紅素誘導的細胞自噬。通過雙熒光素酶報告實驗、qPCR以及免疫印跡雜交對miR-17和miR-20a靶基因進行驗證，確認ATG7是miR-17和miR-20a的下游調(diào)控基因。通過轉(zhuǎn)染缺少ATG7的表達載體進行細胞自噬恢復實驗，結(jié)果進一步明確miR-17和miR-20a

9、通過調(diào)控ATG7抑制雷公藤紅素誘導的細胞自噬。
　　為了明確雷公藤紅素誘導自噬在前列腺癌中的作用，本研究進行了MTT以及克隆形成實驗，結(jié)果顯示細胞自噬被 miR-101、miR-17、miR-20a以及巴弗洛霉素抑制后，活細胞數(shù)以及細胞的克隆形成能力均下降，表明雷公藤紅素誘導的細胞自噬對前列腺癌細胞的存活具有保護效應(yīng)。
　　綜上所述，本研究揭示了AR對細胞自噬的負調(diào)控作用，闡明了雷公藤紅素通過抑制AR，降低自噬抑制因子miR