金黃色葡萄球菌新型耐熱核酸酶(Nuc2)的定點突變和特性分析.pdf

1、耐熱核酸酶是金黃色葡萄球菌的重要毒力因子，屬于非特異性核糖核酸酶。編碼該酶的nuc1基因已被廣泛用作臨床和食品樣本中檢測和鑒定金黃色葡萄球菌污染的靶基因。Nuc2是近年來發(fā)現(xiàn)的新型耐熱核酸酶，不同于過去大多數(shù)文獻中報道的Nuc1。.
　　新型耐熱核酸酶Nuc2與Nuc1相似的保守位點，除了這些保守位點之外，是否還存在一些其它的氨基酸位點對 Nuc2的活性和二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定起著重要作用，本研究根據(jù)Nuc2與Nuc1氨基酸序列的同源比對結(jié)

2、果，結(jié)合 InterPro和PROSITE數(shù)據(jù)庫的序列模式和功能位點分析，選擇了Nuc2中F60、A62、T102和Y135這4個可能的關(guān)鍵位點，采用定點突變的方法構(gòu)建了 T102M、Y135V、F60V/A62L、T102M/Y135V和F60V/A62L/T102M/Y135V這5個Nuc2的單點和多點突變體。對它們進行體外表達并純化上述核酸酶，對其活性、耐熱性和二級結(jié)構(gòu)進行測定。
　　核酸酶活性實驗表明：在Nuc2蛋白的突變

3、體中，除了Y135V的酶活性同野生型的相似外，其它突變體的核酸酶活性與野生型相較均有不同程度的下降；經(jīng)方差分析（p<0.05），T102M和F60A/A62L/T102M/Y135V的核酸酶活性較野生型顯著下降，并且F60A/A62L/T102M/Y135V的酶活性基本喪失。
　　耐熱性實驗表明：100℃加熱處理后，突變型Nuc2的相對酶活力與野生型相比都較低，其中，T102M和F60A/A62L的核酸酶活性隨著熱處理時間的延長而

4、急劇下降。在100℃下加熱120 min，突變體Nuc2的核酸酶活性均已基本喪失，而野生型Nuc2仍然保有40％的酶活性。
　　圓二色譜測定的結(jié)果表明：Y135V和T102M/Y135V的二級結(jié)構(gòu)中α-螺旋結(jié)構(gòu)的含量與野生型的最為接近，而T102M和F60V/A62L中α-螺旋結(jié)構(gòu)的含量顯著低于野生型，F(xiàn)60A/A62L/T102M/Y135V的二級結(jié)構(gòu)中包含有無規(guī)卷曲。
　　因此，推斷T102是維持Nuc2核酸酶活性和二級