Myf5基因在非洲爪蟾原腸胚腹側(cè)方表達的調(diào)控機制.pdf

1、Myf5是一類具有堿性螺旋-環(huán)-螺旋(bHLH)結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子.它在脊椎動物骨骼肌發(fā)育過程中起著重要調(diào)節(jié)作用.人們認為myf5基因在早期胚胎中的表達時相與其在決定肌肉發(fā)生過程中的作用是密切相關(guān)的.在爪蟾中,myf5基因轉(zhuǎn)錄起始于第10期胚胎背唇上方細胞中.隨著原腸運動的進行,該基因的表達區(qū)域很快轉(zhuǎn)移至赤道邊緣帶的背側(cè)方細胞,然后向邊緣帶的腹側(cè)方擴展.Nodal和Activin蛋白都是TGF-beta超家族的成員,而且它們都具有中胚層

2、誘導(dǎo)功能.在爪蟾中已經(jīng)證明Nodal采用和Activin相同或相似的信號傳導(dǎo)機制.內(nèi)源性的Nodal基因在爪蟾胚胎中首先表達在原腸期胚胎的背側(cè)方細胞中,到了原腸運動晚期其表達區(qū)域也向邊緣帶的腹方延伸.這一表達時相強烈暗示我們Nodal信號可能參與了Xmyf5基因在原腸期胚胎赤道邊緣帶腹側(cè)方轉(zhuǎn)錄的調(diào)控.所以,本文的工作著眼于研究負責(zé)爪蟾肌肉主控基因myf5在原腸期腹側(cè)方細胞中表達的分子機制.首先,運用爪蟾動物極帽模型證明Nodal/Act

3、ivin可以在動物極帽中誘導(dǎo)Xmyf5基因的表達.異位表達Xnrl mRNA于胚胎赤道邊緣帶腹側(cè)方同樣可以誘導(dǎo)Xmyf5基因表達.而且,這種異位表達可以被Xnrl的拮抗劑Cerberus-S所抑制.第二,根據(jù)Xmyf5上游啟動子中一段指導(dǎo)基因在原腸期腹側(cè)方表達的839bp序列設(shè)計四個系列缺失的質(zhì)粒.使用這些質(zhì)粒進行的熒光素酶測活實驗以及轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灳砻?在Xmyf5啟動子-4223位到-3798位的這段426 bp序列能夠負責(zé)Xmyf5

4、基因在胚胎原腸期腹側(cè)方表達.第三,在426 bp序列中找到了兩個Smad蛋白的結(jié)合位點(SBEs).凝膠阻滯實驗證明Nodal信號通路中的Smad4蛋白能結(jié)合這兩個SBEs.最后,通過PCR方法構(gòu)建了一系列SBE位點突變的啟動子.熒光素酶測活實驗以及轉(zhuǎn)基因?qū)嶒灲Y(jié)果證明:兩個SBEs是負責(zé)Xmyf5基因響應(yīng)Nodal/Activin信號并且指導(dǎo)報告基因在原腸期胚胎的赤道邊緣帶腹側(cè)方表達所必須的調(diào)控元件.以上實驗結(jié)果說明:Nodal/Act