RHPN2通過調(diào)控Notch通路在肺腺癌中促進腫瘤生成.pdf

1、研究背景:目前，肺癌仍然是全球范圍內(nèi)人類頭號惡性腫瘤殺手。大量研究者們一直以來致力于研究肺癌的發(fā)生機制、肺癌的轉(zhuǎn)移特征、肺癌早期診斷以及治療等，并且取得了相當(dāng)大的進步。然而，由于空氣污染以及吸煙等原因，世界上肺癌的總體發(fā)病率依然居高不下。我國是世界上的肺癌大國，2015年中國惡性腫瘤流行病學(xué)調(diào)查研究數(shù)據(jù)顯示：肺癌在我國的發(fā)病率是733.3/10萬人，是我國發(fā)病率最高的惡性腫瘤。其中男性為509.3/10萬人，女性為224/10萬人。而在

2、腫瘤相關(guān)死亡方面，肺癌也處于首位，死亡率為610.2/10萬人，其中男性432.4/10萬，女性為177.8/10萬。該發(fā)病率和死亡率成上升趨勢，因此對于肺癌的早期篩查和診治顯得異常重要。目前，對于肺癌的早期篩查最佳的方法是低劑量螺旋CT掃描，傳統(tǒng)的治療方法是手術(shù)、放療和化療。然而，由于癥狀隱匿，低劑量螺旋CT仍然會遺漏一些早期腫瘤患者。另外，部分進展期不能接受手術(shù)的患者只能接受放化療，而放化療所伴隨的不良反應(yīng)和并發(fā)癥使很多患者放棄治療

3、。隨著人們對惡性腫瘤認識越來越多，研究者們發(fā)現(xiàn)從細胞分子水平來研究肺癌的發(fā)生發(fā)展以及其生物學(xué)特性對肺癌的防治有著相當(dāng)大的幫助，如分子標記物能早期預(yù)測腫瘤發(fā)展和細胞靶向治療。因此，對肺癌進行生物學(xué)的基礎(chǔ)科研并尋找潛在的生物靶點是目前重點熱點。
　　在肺癌的基礎(chǔ)研究方面，由于新一代測序技術(shù)的發(fā)展使得研究者們可以大規(guī)模對人類腫瘤基因組進行快速準確的測序，從而進一步了解肺癌的發(fā)生發(fā)展機制以及為腫瘤的診治提供潛在的生物細胞靶點。在前期的工作

4、中對肺腺癌的臨床腫瘤樣本以及轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)樣本進行了測序，在測序結(jié)果中我們發(fā)現(xiàn)了 Rho GTP酶結(jié)合蛋白（Rhpn2）在多個不同的肺癌樣本中存在不同程度的突變和表達量改變。Rhpn2在正常機體中能和RhoA結(jié)合，從而激活RhoA相關(guān)的下游細胞信號通路，對細胞的形態(tài)以及細胞內(nèi)肌動蛋白和細胞骨架的形成有著重要的調(diào)控作用。而在腫瘤細胞中，由于 Rhpn2的異常表達可能會使得腫瘤細胞的細胞骨架異常，導(dǎo)致細胞形態(tài)不穩(wěn)定以及細胞粘附功能改變，從而使

5、腫瘤細胞更容易發(fā)生轉(zhuǎn)移。在結(jié)直腸癌和大腦膠質(zhì)瘤中的研究發(fā)現(xiàn)，Rhpn2的異常表達可以引起腫瘤細胞的表皮細胞-間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化（EMT）這生物學(xué)行為發(fā)生，因此腫瘤細胞更容易脫離原發(fā)灶從而轉(zhuǎn)移至其他組織和器官。既往的研究發(fā)現(xiàn)RhoA分子和一些傳統(tǒng)的細胞信號通路有著密切聯(lián)系，目前已發(fā)現(xiàn)與Hippo通路以及Notch通路有不同程度的關(guān)聯(lián)。然而，作為RhoA結(jié)合蛋白的Rhpn2在肺癌發(fā)生發(fā)展過程中所扮演的角色目前尚未有研究。Rhpn2作用的機制也仍

6、未清楚。
　　第一部分Rhpn2在肺腺癌中的表達以及臨床意義
　　實驗?zāi)康?檢測肺腺癌患者臨床腫瘤樣本、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)以及與之配對的癌旁非腫瘤組織中Rhpn2基因mRNA的表達水平。探討Rhpn2表達水平與肺癌患者臨床特征以及預(yù)后的關(guān)系。
　　實驗方法:
　　1.收集了在2011年6月至2011年9月之間以及2011年9月至2012年6月之間于廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院胸外科接受了肺部腫瘤切除術(shù)并且術(shù)后病理提示肺腺癌的

7、患者分別57名及125名。我們提取了患者的新鮮腫瘤標本以及相對應(yīng)的癌旁非腫瘤組織，液氮凍存?zhèn)溆谩Ｆ渲?7名患者作為前期實驗樣本，而125名患者作為驗證樣本。除此以外，我們收集并整理了該125名患者的臨床資料以及其預(yù)后信息。
　　2.提取腫瘤和癌旁組織樣本的RNA，使用逆轉(zhuǎn)錄PCR方法將RNA逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA，再使用 qRT-PCR(熒光定量 PCR)方法檢測腫瘤及癌旁組織樣本的Rhpn2水平，并且對患者進行預(yù)后的隨訪。
　

8、　3.使用 qRT-PCR方法檢測各常見肺癌細胞系（包括：H1975、H460、SPC-A-1、95D、HCC827、H520、PC-9、H358、H1650、H1299和A549）以及正常支氣管上皮細胞（HBE）的Rhpn2水平。我們選取了Rhpn2表達最高的兩個細胞系H1299及A549作為實驗細胞系，使用組蛋白去乙?；福℉DAC）抑制劑（丁酸鈉）對H1299及A549進行處理后，再次檢測未處理及處理過的H1299和A549中Rh

9、pn2的水平。
　　4.所有數(shù)據(jù)使用SPSS軟件19.0進行分析。癌與癌旁組織中的Rhpn2 mRNA比較采用配對t檢驗進行統(tǒng)計學(xué)處理。以中位數(shù)為臨界值分為Rhpn2高表達組和Rhpn2低表達組，使用卡方檢驗(Chi-square test)分析Rhpn2 mRNA表達量與患者臨床生存預(yù)后之間的關(guān)系，并繪制Kaplan-Meier生存曲線，使用Log-rank test比較兩組間生存差異。處理組的H1299及A549與未處理組之間

10、Rhpn2表達水平比較使用t檢驗。P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　實驗結(jié)果:
　　1.前期的測序工作提示在腫瘤組織中Rhpn2的表達明顯高于配對的癌旁組織中的Rhpn2表達，并且結(jié)果由統(tǒng)計學(xué)差異。發(fā)現(xiàn)在驗證組的125名患者中，腫瘤組的Rhpn2表達高于癌旁組織Rhpn2的表達，然而結(jié)果無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。
　　2.在驗證組中125名患者的腫瘤組織中，以癌旁組織的Rhpn2表達量為標準將患者分為 Rhpn2高表達組（n=

11、78）和低表達組（n=47）。Kaplan-Meier曲線以及Log-rank test結(jié)果提示Rhpn2高表達組患者的總生存期（OS）明顯比低表達組的患者差，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　3.在對常見肺癌細胞系中Rhpn2 mRNA水平檢測以及HBE檢測中發(fā)現(xiàn)肺腺癌細胞系 H1299以及 A549中的 Rhpn2水平高于其他腫瘤細胞系以及HBE，其中以A549最明顯。使用HDAC抑制劑處理后的H1299及A549中Rhpn2表達水平明

12、顯高于未作任何處理的 H1299和 A549，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　實驗結(jié)論:
　　1. Rhpn2在肺腺癌組織中有不同程度的表達；Rhpn2在癌組織中的表達水平比癌旁組織高。
　　2.在肺腺癌患者中，Rhpn2高表達的患者較低表達的預(yù)后更差患者差。
　　3. Rhpn2在在大部分肺癌細胞系中的表達均高于在正常支氣管上皮細胞中的表達；Rhpn2在肺腺癌細胞系A(chǔ)549中存在著明顯高表達的現(xiàn)象。
　　第二部分

13、Rhpn2促進肺腺癌細胞增殖、侵襲以及誘導(dǎo)非腫瘤細胞惡性轉(zhuǎn)化
　　實驗?zāi)康?分別建立穩(wěn)定的過表達Rhpn2以及低表達Rhpn2的肺腺癌細胞模型，并且檢測過表達、低表達以及正常表達 Rhpn2的肺腺癌細胞的增殖、侵襲以及轉(zhuǎn)移等細胞功能。通過對不同細胞模型中的功能差異的比較，探討 Rhpn2在腫瘤細胞中的生物學(xué)功能。上調(diào)非腫瘤細胞中的 Rhpn2表達水平，檢測過表達 Rhpn2及未處理的非腫瘤細胞的細胞功能變化，探討過表達 Rhpn2

14、對非腫瘤細胞的細胞功能影響。
　　實驗方法:
　　1.建立表達目標基因的細胞模型：使用設(shè)計的引物通過PCR方法擴增了野生型Rhpn2基因（Rhpn2-WT）以及Rhpn2兩種不同的突變（V73M和H357L）。使用分子克隆方法制備了含有Rhpn2-WT、Rhpn2-V73M、Rhpn2-H357L以及含有Rhpn2靶向短發(fā)卡RNA的質(zhì)粒。另外，通過慢病毒感染技術(shù)分別建立了含有空白載體、過表達Rhpn2-WT、Rhpn2-V7

15、3M、Rhpn2-H357L以及Rhpn2下調(diào)的 H1299和含空白載體及 shRNA-Rhpn2的 A549的肺腺癌細胞模型。使用qRT-PCR方法驗證細胞模型中Rhpn2及其突變體的mRNA表達情況，同時使用了Western blot方法驗證細胞模型中Rhpn2及其突變體的Rhpn2蛋白表達情況，內(nèi)部參照使用β-Actin。
　　2.檢測細胞模型的細胞功能：分別對H1299和A549含有不同表達水平的Rhpn2細胞模型進行細胞

16、功能實驗，實驗內(nèi)容包括了細胞克隆形成實驗和Transwell實驗等，分別檢測不同細胞模型的增殖、生長、遷移和侵襲等細胞功能。
　　3.建立含目標基因的非腫瘤細胞裸鼠種植瘤模型：使用慢病毒感染方法將制備好的含有空白載體、過表達 Rhpn2-WT、Rhpn2-V73M、Rhpn2-H357L以及含Rhpn2靶向短發(fā)卡RNA的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進入非腫瘤細胞，即小鼠纖維母細胞系（NIH-3T3）中。建立了穩(wěn)定的含有空白載體、過表達Rhpn2-WT

17、、Rhpn2-V73M、Rhpn2-H357L和Rhpn2下調(diào)的3T3細胞模型，分別進行軟瓊脂克隆形成實驗。24只年齡為4-6周的BALB/c雄性裸鼠隨機分成4組，分別為對照組（空白載體）、Rhpn2組（Rhpn2-WT）、V73M組（Rhpn2-V73M）和H357L組（Rhpn2-H357L）。分別將處于對數(shù)生長期的含有空白載體、過表達Rhpn2-WT、Rhpn2-V73M以及Rhpn2-H357L的3T3細胞稀釋至2×107cel

18、ls/mL，取每只裸鼠0.1ml分別種植在裸鼠的右側(cè)腹股溝處。
　　4.裸鼠觀察及種植瘤評估：完成細胞種植后每2天觀察裸鼠精神狀態(tài)、活動力、反應(yīng)、飲食、體重、皮膚顏色及右側(cè)腹股溝處的腫瘤形成情況并且測量腫瘤大小。于種植細胞后的3周將裸鼠處死并收集裸鼠右側(cè)腹股溝種植瘤，計算各細胞系種植瘤的體積，公式為：體積=（長徑×短徑2）/2；石蠟包埋各細胞系種植瘤，制備病理H/E染色玻片，200倍顯微鏡下觀察種植瘤細胞情況。任意選取10個高倍鏡

19、視野，計算各組種植瘤的異型細胞數(shù)目。
　　5. Western blot結(jié)果采用ImageJ軟件中的灰度檢測工具量化，再比較各實驗組之間蛋白表達差異。所有數(shù)據(jù)使用SPSS軟件16.0進行分析。各個含目標基因的細胞系中Rhpn2 mRNA表達程度用自然對數(shù)e為底數(shù)計算其取對數(shù)值。結(jié)果記錄為相對表達量，實驗組之間的相對表達量比較使用t檢驗?？寺⌒纬?、軟瓊脂克隆形成以及Transwell實驗中各個實驗組的克隆數(shù)目以及Transwell細

20、胞數(shù)目比較使用t檢驗。裸鼠實驗中，不同實驗組之間的種植瘤體積比較采用t檢驗，不同實驗組的種植瘤病理切片中異型細胞數(shù)目比較采用t檢驗。P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　實驗結(jié)果:
　　1.使用分子克隆技術(shù)以及慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)，建立了H1299的空白載體、過表達Rhpn2-WT以及Rhpn2兩個突變體（V73M和H357L）的細胞模型。另外，通過轉(zhuǎn)入靶點為 Rhpn2的 shRNA，獲得了低表達 Rhpn2的 H1299和A549

21、細胞模型。qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)shRNA-Rhpn2的H1299及A549細胞中的Rhpn2表達明顯低于空白載體的H1299和A549細胞，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。Western blot結(jié)果提示含Rhpn2-WT和Rhpn2兩個突變體（V73M和H357L）的H1299細胞模型總Rhpn2蛋白表達明顯高于含空白載體的H1299細胞。結(jié)果提示細胞模型建立成功。
　　2.在細胞功能實驗中，空白載體的 A549細胞克隆形成數(shù)目明顯多于含s

22、hRNA-Rhpn2的A549細胞（115.3±7.22個vs34.67±1.86個,p=0.0004），結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)差異?？瞻纵d體的H1299細胞克隆形成數(shù)目明顯多于含shRNA-Rhpn2的H1299細胞（97.75±2.96個vs35.5±1.71個, p<0.0001），結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)差異。過表達Rhpn2、Rhpn2-V73M和Rhpn2-H357L的H1299細胞的克隆形成數(shù)目明顯較空白載體的H1299多。在Transwell

23、實驗中，shRNA-Rhpn2的H1299和A549細胞的細胞遷移數(shù)目明顯少于空白載體的 H1299細胞（100.7±1.76個 vs52.33±3.18個,p=0.0002）和A549細胞(102.7±3.76個vs52.67±2.08個,p=0.0003)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　3.在3T3細胞的軟瓊脂克隆形成實驗中，發(fā)現(xiàn)含有 Rhpn2-V73M和Rhpn2-H357L的3T3細胞的克隆形成數(shù)目明顯多于空白載體和含有 Rh

24、pn2-WT的3T3細胞，結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)差異。另外，實驗發(fā)現(xiàn)含Rhpn2突變體的3T3細胞，其軟瓊脂克隆灶的大小明顯超過空白載體及Rhpn2-WT的3T3細胞。取24只BALB/c雄性裸鼠隨機分成4組進行細胞懸液注射。由于在進行V73M及H357L組注射時出現(xiàn)細胞懸液漏出，因此從對照組及Rhpn2野生組中隨機取兩只裸鼠放入V73M及H357L組。各組裸鼠無意外死亡，種植瘤成瘤率100％。各組裸鼠體重、活動度等均無明顯變化，皮膚顏色紅潤無蒼

25、白。
　　4.種植成功后3周將裸鼠處死，取出各組裸鼠右側(cè)腹股溝種植瘤分別稱重并計算種植瘤體積。結(jié)果提示Rhpn2組、V73M組和H357L組的種植瘤都比對照組的種植瘤重，結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)差異，其中Rhpn2組的種植瘤重量最大。Rhpn2組、V73M組和 H357L組的種植瘤體積均大于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，而Rhpn2組的種植瘤體積最大。石蠟包埋種植瘤并制成H/E染色病理玻片，在每10個高倍鏡中，Rhpn2組、V73M組和H357L

26、組的異常有絲分裂細胞數(shù)均多于對照組，結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)差異，其中V73M組的異常細胞數(shù)目在4個組中最高。
　　實驗結(jié)論:
　　1. Rhpn2及其兩個突變體在體外能促進肺腺癌細胞生長、遷移和侵襲功能，下調(diào)Rhpn2表達則能抑制該細胞功能。
　　2. Rhpn2及其兩個突變體能在體外增強非腫瘤細胞3T3在惡劣環(huán)境下的生長能力。
　　3.高表達Rhpn2及其兩個突變體的非腫瘤細胞在動物體內(nèi)成瘤能力明顯比普通非腫瘤細胞強，而

27、且實驗組的異形有絲分裂細胞數(shù)明顯多于對照組，說明Rhpn2及突變體可能有誘導(dǎo)非腫瘤細胞惡性轉(zhuǎn)化的能力。
　　第三部分 Rhpn2與Hippo通路和Notch通路的關(guān)系研究
　　實驗?zāi)康?在上調(diào)及下調(diào) Rhpn2在肺腺癌細胞中的表達水平后，檢測 Hippo和 Notch等通路中的關(guān)鍵因子表達水平。探討Rhpn2與Hippo和Notch等通路的關(guān)系，以及Rhpn2調(diào)控作用。
　　實驗方法:
　　1. Rhpn2與Rh

28、oA能結(jié)合，而RhoA與Hippo通路關(guān)系密切，因此在含有空白載體、表達Rhpn2、Rhpn2-V73M和Rhpn2-H357L的H1299細胞中檢測RhoA活性。在實驗前給與細胞無血清培養(yǎng)基血清饑餓過夜，在收集細胞前10分鐘給與細胞10%血清刺激。使用蛋白裂解液和細胞刷收集含目的基因的H1299細胞蛋白，液氮速凍后使用冰盒保存。各組蛋白加入Rho GST在4℃孵育1小時。將樣本離心并去除上清液，使用試劑盒專用裂解液對孵育產(chǎn)物進行裂解，

29、使用Western blot方法檢測樣本中的GTP-RhoA和RhoA的蛋白表達量。
　　2.為了研究Rhpn2與Hippo通路關(guān)鍵因子YAP及磷酸化YAP（p-YAP）關(guān)系，收集了表達空白載體、Rhpn2及其突變體的 H1299細胞總蛋白，使用標準蛋白描繪標準蛋白曲線并計算所收集細胞的蛋白含量。使用Western blot方法和特異性抗體檢測了不同細胞中的YAP和p-YAP表達情況，內(nèi)部參照使用β-Actin。
　　3.為

30、了發(fā)現(xiàn)Rhpn2與Notch信號通路的聯(lián)系，我們收集了表達空白載體以及表達shRNA-Rhpn2的H1299細胞的RNA,使用逆轉(zhuǎn)錄PCR將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再使用qRT-PCR方法檢測了兩組細胞中Notch信號通路中的關(guān)鍵因子或靶向基因，包括了DLL1、DLL3、HES1、HES7、Lfng、Notch1和Nrarp等。
　　4.收集了表達空白載體、Rhpn2-WT、Rhpn2-V73M和 Rhpn2-H357L的 H12

31、99細胞中的總蛋白，使用標準蛋白描繪標準蛋白曲線并計算所收集細胞的蛋白含量，使用Western blot方法和HES1抗體檢測各細胞中HES1蛋白表達程度。使用γ-分泌酶抑制劑DAPT處理含空白載體的H1299細胞作為陽性對照，shRNA-Rhpn2的H1299細胞則未經(jīng)過DAPT處理，使用qRT-PCR方法檢測HES1 mRNA表達量。EDTA能激活Notch通路從而上調(diào)HES1表達，因此使用Western blot方法檢測了未處理、

32、PBS處理、EDTA處理后0.5小時和EDTA處理后1小時的含空白載體和 shRNA-Rhpn2的 H1299細胞，內(nèi)部參照使用β-Actin。最后，使用qRT-PCR方法檢測經(jīng)過血清饑餓過夜以及饑餓后血清刺激6小時的含目標基因的H1299細胞（空白載體、Rhpn2-WT以及Rhpn2兩種突變體）中的HES1表達的。
　　5.所有數(shù)據(jù)使用SPSS軟件19.0進行分析。Western blot結(jié)果使用ImageJ的灰度檢測功能量化。

33、量化后實驗組之間的比較使用t檢驗，qRT-PCR的檢測結(jié)果以自然對數(shù)e為底數(shù)計算其對數(shù)值。結(jié)果記錄為相對表達量，實驗組之間的相對表達量比較使用t檢驗，P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　實驗結(jié)果:
　　1.在RhoA活性實驗中，發(fā)現(xiàn)血清刺激能明顯增加H1299細胞中的活化RhoA的蛋白表達量，然而在表達Rhpn2-WT的H1299細胞中，沒發(fā)現(xiàn)血清刺激能增加活化 RhoA的蛋白表達量。同樣在無血清刺激的情況下， Rhpn2-W

34、T比對照組能增加活化 RhoA的蛋白量。在 Rhpn2-V73M組和Rhpn2-H357L組H1299細胞中，發(fā)現(xiàn)血清刺激后活化的RhoA蛋白表達量比無血清刺激時更低。
　　2.在檢測含各目標基因的H1299細胞中YAP和p-YAP的實驗中，發(fā)現(xiàn)對照組和各實驗組的YAP蛋白表達量之間無差異，而Rhpn2-WT、Rhpn2-V73M和Rhpn2-H357L組的p-YAP蛋白表達量明顯高于對照組的p-YAP表達量，其中以Rhpn2-V

35、73M最明顯，說明Rhpn2高表達可以增加p-YAP的表達量。
　　3.在對多個潛在靶向基因的表達水平檢測中，發(fā)現(xiàn)在 shRNA-Rhpn2的H1299細胞中，HES1的表達量明顯低于表達空白載體的H1299細胞。同時在A549細胞中，表達 shRNA-Rhpn2的細胞 HES1的表達量明顯低于空白載體的A549細胞。
　　4.在 EDTA刺激實驗中，發(fā)現(xiàn)對照組和 PBS中含空白載體和shRNA-Rhpn2的H1299中，H

36、ES1蛋白表達無明顯變化。在經(jīng)過EDTA刺激0.5小時后，含 shRNA-Rhpn2的 H1299中的 HES1蛋白表達明顯低于空白載體的H1299細胞。在經(jīng)過EDTA刺激1小時后，含shRNA-Rhpn2的H1299中HES1蛋白表達仍然低于空白載體的H1299。然而，與EDTA刺激0.5小時相比，HES1蛋白的表達程度明顯降低。還發(fā)現(xiàn)含 Rhpn2-WT、Rhpn2-V73M和Rhpn2-H357L的H1299細胞中HES1蛋白表達

37、高于空白對照組的HES1蛋白表達。
　　5.經(jīng)過血清刺激6小時后，發(fā)現(xiàn)在對照組及各實驗組中， HES1的mRNA表達水平均比未接受血清刺激時高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。而無論是否接受血清刺激，Rhpn2-WT、Rhpn2-V73M和Rhpn2-H357L組的HES1表達水平均高于對照組，結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)差異。其中 Rhpn2-WT在接受血清刺激6小時后HES1表達水平最高。
　　實驗結(jié)論:
　　1.在無血清刺激下， Rhpn2-

38、WT能增加活化 RhoA的表達水平， Rhpn2-V73M則能抑制RhoA活化。在血清刺激下，Rhpn2-WT未能上調(diào)活化RhoA的表達水平。然而，Rhpn2突變體能明顯抑制RhoA活化。
　　2. Rhpn2-WT以及其突變體能明顯上調(diào)p-YAP蛋白表達。作為YAP的活化形式，p-YAP可以抑制Hippo通路。即Rhpn2可以通過活化YAP間接抑制Hippo通路。
　　3.在H1299及A549細胞中，抑制Rhpn2表達可

39、明顯抑制HES1的表達。在mRNA水平，過表達Rhpn2-WT以及Rhpn2突變體可以明顯上調(diào)HES1的表達水平，該現(xiàn)象在接受血清刺激6小時后更加明顯。而在蛋白水平，過表達Rhpn2-WT以及Rhpn2突變體可以小幅度上調(diào)HES1的表達。
　　4.抑制Rhpn2表達可以明顯抑制HES1的表達。在Notch通路激動劑EDTA刺激后0.5小時，HES1蛋白表達明顯升高。1小時后，HES1蛋白表達程度較0.5小時下降。然而，抑制Rhpn

40、2表達仍然可以在EDTA刺激下明顯下調(diào)HES1的蛋白表達。說明Rhpn2可通過與HES1作用而調(diào)控Notch通路。
　　全文總結(jié):
　　1.高表達Rhpn2的肺腺癌患者其預(yù)后不佳。Rhpn2可以增強肺腺癌細胞的增殖、侵襲能力，同時Rhpn2可以使非腫瘤細胞出現(xiàn)惡性轉(zhuǎn)化，增強惡性生物學(xué)行為。
　　2.在無血清刺激情況下，Rhpn2可以增加RhoA的活性，從而間接抑制Hippo通路的激活。然而Rhpn2卻可以增加p-YAP