巨噬細(xì)胞極化微環(huán)境促肺癌發(fā)生與藥物治療.pdf

1、腫瘤的惡性進(jìn)展與巨噬細(xì)胞極化微環(huán)境密切相關(guān)。在腫瘤的形成中，極化的M2型巨噬細(xì)胞創(chuàng)造了一種炎性環(huán)境促進(jìn)腫瘤生長。然而，巨噬細(xì)胞極化微環(huán)境與腫瘤進(jìn)展是否有直接關(guān)系，至今尚無定論。因此，明確巨噬細(xì)胞極化微環(huán)境促進(jìn)腫瘤發(fā)展的機(jī)制對(duì)腫瘤治療甚為關(guān)鍵。本課題以肺癌為研究對(duì)象，目的是研究巨噬細(xì)胞極化微環(huán)境對(duì)肺癌的促進(jìn)及藥物治療，以期為肺癌防治提供有效措施。
　　本研究首先考察體外巨噬細(xì)胞極化微環(huán)境對(duì)LLC細(xì)胞是否有直接影響，采用小鼠腹腔巨噬細(xì)

2、胞（PEMs），用LPS（10 ng/ml）將PEMs極化為M1型巨噬細(xì)胞；用IL-4（10 ng/ml）誘導(dǎo)PEMs為M2型巨噬細(xì)胞；通過熒光雙染法檢測極化的巨噬細(xì)胞與LLC細(xì)胞共培養(yǎng)；MTT法和PCNA免疫熒光法檢測巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基對(duì)LLC細(xì)胞增殖影響；細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)分析巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基對(duì)LLC細(xì)胞遷移、侵襲的關(guān)系。此外，本課題還研究了體外巨噬細(xì)胞極化微環(huán)境對(duì)新生血管生成的影響，MTT法和PCNA免疫熒光法

3、檢測巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）的促增殖作用；伊文斯蘭滲出法檢測HUVEC細(xì)胞體外通透性；雞胚尿囊膜（CAM）模型研究巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基對(duì)新生血管形成的影響。接著，為探索巨噬細(xì)胞極化微環(huán)境促癌機(jī)制，我們用AO/EB熒光雙染法檢測細(xì)胞凋亡；免疫熒光法檢測自噬相關(guān)蛋白LC3-B、P62表達(dá)；DQ-Green BSA降解實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞溶酶體活性；DAF-2 DA和DCF-DA分別檢測細(xì)胞內(nèi)NO和ROS。最后，我們建立烏拉坦

4、誘導(dǎo)的小鼠肺癌模型，流式細(xì)胞術(shù)和Western Blot檢測肺癌小鼠肺泡細(xì)胞中巨噬細(xì)胞表型；ELISA試劑盒檢測肺癌小鼠血清中5-HIAA和肺泡灌洗液中IFN-γ、IL-12、TNF-α、TGF-β、IL-10、IL-4含量；免疫組化法檢測小鼠肺組織中LC3-B、P62和CD31蛋白的表達(dá)；伊文斯蘭滲出法檢測肺血管通透性。另外，為充分證明巨噬細(xì)胞極化微環(huán)境促進(jìn)肺癌發(fā)生的機(jī)制，我們使用巨噬細(xì)胞耗竭劑、自噬抑制劑和血管保護(hù)劑治療肺癌小鼠，觀

5、察其對(duì)肺癌發(fā)生的阻止作用。
　　本研究表明，M1型巨噬細(xì)胞對(duì)LLC細(xì)胞吞噬能力明顯比極化前強(qiáng)，而M2型巨噬細(xì)胞對(duì)LLC細(xì)胞吞噬能力明顯比極化前弱。極化的M1型和M2型巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基對(duì)LLC細(xì)胞增殖、遷移、侵襲無明顯影響，然而，我們意外的發(fā)現(xiàn)M2型巨噬細(xì)胞條件化培養(yǎng)基能促進(jìn)體外HUVEC的增殖、增加HUVEC細(xì)胞體外通透性、誘導(dǎo)雞胚尿囊膜（CAM）新生血管形成，而M1型巨噬細(xì)胞條件化培養(yǎng)基對(duì)此沒有影響。機(jī)制研究顯示，1％血清饑餓

6、條件下，M2型巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)基明顯增加HUVEC細(xì)胞自噬小體及LC3-B蛋白表達(dá)，但減少自噬底物P62蛋白和DQ-Green BSA的降解，而自噬抑制劑氯喹在不影響HUVEC細(xì)胞增殖濃度下降低HUVEC通透性。此外，我們也發(fā)現(xiàn)，M2型巨噬細(xì)胞條件化培養(yǎng)基可以增加HUVEC細(xì)胞內(nèi)NO和ROS水平，使用氯喹抑制自噬后可降低細(xì)胞內(nèi)NO和ROS水平。最后，我們在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中觀察到烏拉坦誘導(dǎo)的小鼠肺癌增加肺泡M2型巨噬細(xì)胞比例，促進(jìn)肺組織LC3-