石斛活性成分毛蘭素的構(gòu)效關(guān)系及其相互作用蛋白的分離鑒定.pdf

1、目的:毛蘭素是從中藥鼓槌石斛中提取出來的一種低分子量的聯(lián)芐類天然產(chǎn)物。目前研究表明毛蘭素對結(jié)腸癌、膀胱癌、肝癌、胃癌、黑色素瘤等癌細胞具有明顯的增殖抑制和促凋亡的作用，但是對于毛蘭素的構(gòu)效關(guān)系及作用靶點仍未有報道。本文主要探討毛蘭素的構(gòu)效關(guān)系及其直接相互作用蛋白的分離鑒定。
　　方法:首先設(shè)計并通過化學(xué)合成6種毛蘭素類似物，采用羥乙氧基、羥基和羥乙基分別修飾毛蘭素，然后通過細胞增殖MTT法檢測其對HepG2細胞的活性，探討其初步的

2、構(gòu)效關(guān)系并篩選出活性類似物和非活性類似物;針對PAL-ABPP策略，我們以L-賴氨酸為骨架，設(shè)計并合成7種PAL-ABPP活性探針，然后通過MTT法檢測其活性，篩選出活性最佳的探針，并通過Pull down實驗驗證PAL-ABPP策略是否適用于毛蘭素靶點的鑒定;針對PAL-CC-ABPP的策略，我們設(shè)計了3種活性探針、一種非活性探針以及空白探針，再通過MTT法檢測其活性，篩選出活性最佳的探針，并通過與BSA的Pull down檢驗PAL

3、-CC-ABPP方法是否適用于毛蘭素靶點的鑒定;通過Pull down和銀染以及Western blot，檢測非活性探針組與活性探針組之間的特異性蛋白，并通過質(zhì)譜鑒定。
　　結(jié)果:通過化學(xué)合成得到了6種毛蘭素類似物、7種PAL-ABPP活性探針、3種PAL-CC-ABPP活性探針以及一種非活性探針和空白探針，并且通過1H NMR與質(zhì)譜確認了結(jié)構(gòu);MTT結(jié)果表明首先經(jīng)羥乙氧基修飾苯環(huán)的毛蘭素類似物1～4與毛蘭素相比活性明顯較弱，但是

4、經(jīng)羥基和羥乙基修飾C-7位的類似物5和6的活性與毛蘭素基本相當(dāng)，最終確立了6為活性探針的活性基團，4為非活性探針中的非活性基團;其次，以L-賴氨酸為骨架的7種PAL-ABPP活性探針均無活性;還有，3種PAL-CC-ABPP活性探針中僅在N3-α-L-賴氨酸的ε-氨基處引入雙吖丙啶的探針16有活性，而其余活性探針包括非活性探針和空白探針均無活性;Pull down和銀染結(jié)果表明在100～150 kD之間活性探針組中有一條明顯的特異性條帶

5、，Western blot結(jié)果表明在相同的位置上活性探針組中檢測到了Biotin標(biāo)記的蛋白，且非活性探針組中并未檢測到，進一步說明了該特異性蛋白是由活性探針捕獲并標(biāo)記得到的，隨后質(zhì)譜檢測分析表明該特異性蛋白為一種線粒體代謝酶。
　　結(jié)論:首先毛蘭素中C-7可作為重要的修飾位點，A和B環(huán)中的官能團如甲氧基和羥基是毛蘭素的活性必須基團，并且AB環(huán)的立體構(gòu)象對毛蘭素的活性也同樣重要;其次，PAL-ABPP的方法不適用于鑒定毛蘭素靶點;再

6、次，PAL-CC-ABPP探針16的活性并不是由引入的光交聯(lián)基團與賴氨酸部分而是活性基團所決定的，并且PAL-CC-ABPP策略適用于毛蘭素靶點的鑒定;最后，活性探針組中的特異性蛋白（線粒體代謝酶）可能為毛蘭素的靶點。此次研究進一步為深入的毛蘭素構(gòu)效關(guān)系的探討和后續(xù)的靶點確定與驗證工作及其抗癌分子機制的闡明奠定了基礎(chǔ)，并且首次開創(chuàng)的以N3-α-L-賴氨酸為骨架和雙吖丙啶為光交聯(lián)基團的PAL-CC-ABPP方法有望應(yīng)用于小分子藥物的靶點鑒