病原體特異性核酸序列標(biāo)簽篩選流程的建立及標(biāo)簽qPCR陣列驗(yàn)證.pdf

1、病原體的檢偵是傳染病防控的重要環(huán)節(jié)，面對(duì)上千種已知和未知病原體，傳統(tǒng)的病原體分離培養(yǎng)存在盲目性，通量低，周期較長(zhǎng)，病原體的確認(rèn)需要流行病學(xué)、病原學(xué)、血清學(xué)、形態(tài)學(xué)及免疫組織化學(xué)等多方面證據(jù)。且有的病原體無(wú)法分離培養(yǎng)，有的病原體沒(méi)有易感的動(dòng)物模型可以驗(yàn)證。如果在傳染病發(fā)生的早期先對(duì)病原體核酸或蛋白進(jìn)行快速高通量檢偵，縮小可疑感染病原體的鑒別范圍，可為后續(xù)病原體分離鑒定、血清學(xué)檢測(cè)、臨床診斷和對(duì)癥治療提供方向。
　　隨著二代測(cè)序技術(shù)的

2、廣泛應(yīng)用，物種和病原體基因組信息呈爆炸性增長(zhǎng)，基因組大數(shù)據(jù)的挖掘和利用成為生物、醫(yī)藥領(lǐng)域大數(shù)據(jù)應(yīng)用的前沿領(lǐng)域。要實(shí)現(xiàn)病原體的高通量快速檢偵，基礎(chǔ)則在于構(gòu)建完整、高效的病原體標(biāo)簽序列數(shù)據(jù)庫(kù)，所謂病原體標(biāo)簽序列(signature)，是指能夠用來(lái)檢測(cè)病原體存在和能區(qū)分其與其它病原體的特異性核酸序列。而要構(gòu)建完整、高效的病原體標(biāo)簽序列數(shù)據(jù)庫(kù)，則必須通過(guò)基于大數(shù)據(jù)的智能計(jì)算過(guò)程，建立適合的算法和標(biāo)簽序列比對(duì)及輸出流程。
　　本研究以衛(wèi)生部

3、2006年發(fā)布的《人間流傳的主要致病微生物》目錄、羅恩杰主編《病原生物學(xué)》、李凡和徐志凱主編《醫(yī)學(xué)微生物學(xué)》[6,7]，列出當(dāng)前主要致病567種病原體目錄為基礎(chǔ)，結(jié)合16S序列專(zhuān)業(yè)庫(kù) Silva(http://www.arb-silva.de/contact/)、細(xì)菌致病基因VFDB庫(kù)(http://www.mgc.ac.cn/VFs/main.htm)、耐藥基因ARDB庫(kù)(http://ardb.cbcb.umd.edu/)，旨在摸索

4、構(gòu)建出一套高效實(shí)用的病原體特異性核酸標(biāo)簽篩選體系。并在篩選體系基礎(chǔ)上，提出分級(jí)標(biāo)簽策略，即：屬標(biāo)簽+種標(biāo)簽+致病基因標(biāo)簽+耐藥基因標(biāo)簽共同表征/定義病原體，最終實(shí)現(xiàn)多靶點(diǎn)全覆蓋達(dá)到一次性檢測(cè)所有病原體及其致病耐藥特征的理想目標(biāo)。通過(guò)研究，取得了如下階段性成果：
　　1）在MUMmer+Insignia基礎(chǔ)上摸索建立了核酸特異性標(biāo)簽自主篩選流程TMMU signature workflow，并實(shí)現(xiàn)流程可視化。流程將比對(duì)背景縮小到所有

5、目標(biāo)病原體核酸序列集合，同時(shí)為加快MUMmer匹配后Insignia過(guò)程，對(duì)文件按照Taxon進(jìn)行了切分。為減少特異性標(biāo)簽流失，將BLAST庫(kù)設(shè)為Nt庫(kù)與WGS序列庫(kù)集合，并剔除其中所有人工合成序列。BLAST篩選設(shè)置兩個(gè)重要參數(shù)，一是按名稱(chēng)（雙重）判定是否同種病原體，二是將覆蓋度設(shè)為90％，即標(biāo)簽若與其它物種序列覆蓋度達(dá)到90%，則標(biāo)簽判定為不特異；
　　2）通過(guò)多種計(jì)算驗(yàn)證，TMMU signature workflow精確計(jì)

6、算流程不適于細(xì)菌屬標(biāo)簽比對(duì)（無(wú)論是基于16S序列，還是基于屬間全基因組序列），屬標(biāo)簽可利用clustal Omega找到屬保守區(qū)段，再通過(guò)多條標(biāo)簽檢測(cè)來(lái)覆蓋個(gè)別堿基差異，達(dá)到提示病原體屬存在的檢偵結(jié)果；
　　3）TMMU signature workflow精確計(jì)算流程不僅適用于有全基因組的DNA序列，也適用于有全基因組的RNA序列。同時(shí)還適用于短序列（16S序列除外，同屬間辨識(shí)度不夠，無(wú)法區(qū)分到種），沒(méi)有全基因組的病原體和致病基

7、因、耐藥基因片段序列，也可通過(guò)同種、同基因短序列間不求交策略進(jìn)入流程獲得特異性標(biāo)簽序列；
　　4）建立了15種高致病出血熱病毒qPCR陣列和29種分枝桿菌qPCR陣列，經(jīng)驗(yàn)證以ZEBOV為代表的高致病出血熱病毒qPCR陣列，陽(yáng)性質(zhì)粒5×107-5×101拷貝/μl做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)相關(guān)系數(shù) R2＞0.99，靈敏度可達(dá)5×101拷貝。準(zhǔn)確性重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果批內(nèi)變異系數(shù)（CV）為0.88%-2.50%、批間CV為1.75%-3.31%。以結(jié)核桿

8、菌等為代表的29種分枝桿菌qPCR陣列，陽(yáng)性質(zhì)粒5×107-5×103拷貝/μl做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)相關(guān)系數(shù)R2＞0.99，靈敏度可達(dá)5×103拷貝。兩條結(jié)核桿菌探針，23例結(jié)核桿菌痰涂陽(yáng)性樣本檢測(cè)均陽(yáng)性，20例結(jié)核桿菌痰涂陰性患者檢測(cè)均陰性，特異性100%，敏感性100%。以9例GeneX-pert MTB（賽沛）檢測(cè)陽(yáng)性樣本為對(duì)照，1號(hào)探針檢測(cè)有7個(gè)樣本陽(yáng)性，2號(hào)探針檢測(cè)有7個(gè)樣本陽(yáng)性，兩條探針陽(yáng)性結(jié)果不完全重疊，出現(xiàn)互補(bǔ)，共有8個(gè)樣本陽(yáng)性。