Harpin蛋白HpaG功能片段鑒定及應(yīng)用與HrpN-,Ea-誘導(dǎo)植物抗蟲(chóng)性的一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制.pdf

1、革蘭氏陰性植物病原細(xì)菌產(chǎn)生的harpin蛋白質(zhì)在植物上可以引起多種效應(yīng)，包括抗病、抗蟲(chóng)、抗旱，促進(jìn)植物生長(zhǎng)等。作為一種多功能激發(fā)子，它非常有利于研究植物在生長(zhǎng)發(fā)育、抗病防衛(wèi)、抗蟲(chóng)和抗逆等過(guò)程中的相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制。于是，harpin如何被植物識(shí)別，如何引發(fā)各種效應(yīng)，并且這些反應(yīng)中有哪些信號(hào)通路參與，以及harpin如何實(shí)現(xiàn)這些功能等多個(gè)問(wèn)題成為了研究的重點(diǎn)。本研究著重剖析harpin促進(jìn)植物生長(zhǎng)、誘導(dǎo)抗病和抗蟲(chóng)的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)

2、制。
　　 一、水稻細(xì)菌性條斑病菌harpin蛋白HpaGxooc誘導(dǎo)植物抗病和促進(jìn)植物生長(zhǎng)的功能片段鑒定
　　 Harpin是由植物病原細(xì)菌產(chǎn)生的一類(lèi)蛋白質(zhì)激發(fā)子，可以激發(fā)非寄主植物產(chǎn)生過(guò)敏性細(xì)胞死亡(hypersensitive cell death，HCD)，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生防衛(wèi)反應(yīng)，促進(jìn)植物生長(zhǎng)。其中，后兩種效應(yīng)對(duì)植物有益，并且可能是通過(guò)蛋白質(zhì)不同的功能域?qū)崿F(xiàn)的。本研究分離鑒定和檢測(cè)了來(lái)自于水稻條斑病細(xì)菌(Xanth

3、omonas oryzae pv.oryzicola)的一個(gè)137個(gè)氨基酸的harpin蛋白HpaGxooc的九個(gè)功能片段，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)分別施用于煙草(Nicotiana tabaccum)和水稻(Oryza sativa)能產(chǎn)生不同的效應(yīng)。相比較HpaGxooc全長(zhǎng)蛋白，HpaG10-42誘導(dǎo)水稻對(duì)白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)和稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)產(chǎn)生抗性能力最強(qiáng)；

4、HpaG1-94促進(jìn)水稻生長(zhǎng)能力最強(qiáng)；而HpaG62-137誘導(dǎo)過(guò)敏性細(xì)胞死亡(hypersensitive cell death， HCD)能力最強(qiáng)。同時(shí)，HpaG62-137誘導(dǎo)HCD標(biāo)志基因效果強(qiáng)于HpaGxooc全長(zhǎng)蛋白質(zhì)，HpaG10-42對(duì)水稻防衛(wèi)反應(yīng)基因和生長(zhǎng)相關(guān)基因的誘導(dǎo)活性明顯強(qiáng)于HpaGxooc。由此可以解釋我們所觀察到的蛋白質(zhì)有益效應(yīng)。
　　 二、HpaGxooc小分子功能片段HpaG10-42誘導(dǎo)水稻抗病

5、性和提高稻米產(chǎn)量
　　 在第一章的研究中，產(chǎn)生的功能片段HpaG10-42，相比較HpaGxooc全長(zhǎng)蛋白，在煙草上不誘導(dǎo)明顯的細(xì)胞死亡，能促進(jìn)水稻更快的生長(zhǎng)，同時(shí)能誘導(dǎo)水稻對(duì)白葉枯病菌(X.oryzae pv.oryzae)和稻瘟病菌(Magnaporthe grisea)產(chǎn)生較理想的抗性。本研究將HpaG10-42應(yīng)用在水稻田間，研究HpaG10-42對(duì)水稻稻瘟病和水稻白葉枯病的控制效果以及對(duì)產(chǎn)量的影響。結(jié)果顯示：在水稻苗期

6、、返青期、分蘗后期、始穗期連續(xù)使用四次，同對(duì)照處理相比，6，6,6，6μg/ml的Hpa G10-42使水稻白葉枯病(X.oryzae pv.oryzae)和穗頸瘟(Magnaporthe grisea)的病情指數(shù)均顯著降低，并使產(chǎn)量明顯提高，而且效果好于高濃度的Hpa Gxooc；在水稻四個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期僅用6μg/ml HpaG10-42處理一次，也可誘導(dǎo)水稻該生長(zhǎng)時(shí)期的抗病性，但不如連續(xù)多次使用效果好；經(jīng)過(guò)比較，HpaG10-42與化學(xué)

7、農(nóng)藥的使用效果相當(dāng)；在9個(gè)測(cè)試水稻品種上均能誘導(dǎo)抗病性和增加產(chǎn)量，但在不同水稻品種之間存在差異；在田間大面積示范實(shí)驗(yàn)中HpaG10-42效果穩(wěn)定。
　　 三、HrpNEa誘導(dǎo)蚜蟲(chóng)趨避和抑制取食需要EIN2介導(dǎo)的韌皮部防衛(wèi)反應(yīng)
　　 HrpNEa是由梨火疫病菌(Erwinia amylovora)產(chǎn)生的harpin激發(fā)子。本實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)HrpNEa誘導(dǎo)擬南芥抑制蚜蟲(chóng)的繁殖需要乙烯信號(hào)通路重要因子EIN2，但是沒(méi)有研究蚜蟲(chóng)趨避

8、情況，同時(shí)也沒(méi)有明確蚜蟲(chóng)取食與蚜蟲(chóng)趨避的關(guān)系。本研究結(jié)果表明，HrpNEa誘導(dǎo)蚜蟲(chóng)趨避。用羅丹明B標(biāo)記、EPG(Electrical Penetration Graph)技術(shù)監(jiān)測(cè)蚜蟲(chóng)的取食情況，結(jié)果表明HrpNEa抑制蚜蟲(chóng)的取食活動(dòng)，同趨避效應(yīng)有關(guān)。HrpNEa處理后，植物乙烯含量升高，并且乙烯生物合成抑制劑部分抑制HrpNEa的作用。在乙烯信號(hào)通路突變體ein5-1中，HrpNEa能夠象在Col-0中一樣誘導(dǎo)趨避效應(yīng)，但在ein2-1

9、中不能。表明HrpNEa誘導(dǎo)趨避效應(yīng)需要EIN2。原位雜交結(jié)果表明，HrpNEa處理后可以誘導(dǎo)韌皮部相關(guān)蛋白基因AtPP2在韌皮部的表達(dá)，與韌皮部防衛(wèi)反應(yīng)(plantphloem-related defense， PRD)的作用模式一致，而PRD在防衛(wèi)刺吸式昆蟲(chóng)取食中起作用。RT-PCR結(jié)果顯示，HrpNEa可以誘導(dǎo)AtPP2在野生型擬南芥Col-0中的表達(dá)，但是在ein2-1突變體中不能。韌皮部相關(guān)蛋白在韌皮部的表達(dá)通常伴隨有胼胝質(zhì)的

10、沉積，化學(xué)發(fā)光實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，HrpNEa同樣可以誘導(dǎo)胼胝質(zhì)在Col-0中的沉積，但是在ein2-1突變體中不能。因此，本研究結(jié)果表明HrpNEa誘導(dǎo)抗蟲(chóng)趨避效應(yīng)、激發(fā)PRD反應(yīng)，且ET信號(hào)傳導(dǎo)因子EIN2參與了該過(guò)程。
　　 四、參與HrpNEa誘導(dǎo)擬南芥抗蟲(chóng)作用轉(zhuǎn)錄因子的篩選
　　 通過(guò)RT-PCR方法對(duì)擬南芥Col-0中受HrpNEa誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行篩選。在研究的37個(gè)轉(zhuǎn)錄因子中，初步篩選到21個(gè)受HrpNEa誘導(dǎo)

11、上調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子，隨機(jī)選取13個(gè)基因用Northern方法驗(yàn)證，其中有12個(gè)基因被誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)。Realtime RT-PCR進(jìn)一步篩選的結(jié)果顯示，AtMYB51，AtMYB38，AtMYB108，AtMYB30,AtMYB44，AtERF11，RAP2.12,F15H21.12和AtHB-7被不同程度的誘導(dǎo)表達(dá)，AtMYB44被誘導(dǎo)的效果最為明顯。同時(shí)對(duì)37個(gè)突變體中蚜蟲(chóng)趨避以及蚜蟲(chóng)繁殖情況進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，在atmyb44突變體中

12、，HrpNEa誘導(dǎo)后趨避率最小，對(duì)蚜蟲(chóng)繁殖情況沒(méi)有明顯影響。因此，HrpNEa誘導(dǎo)抗蟲(chóng)的效果在atmyb44突變體中被嚴(yán)重阻斷。通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子基因被HrpNEa誘導(dǎo)的情況，結(jié)合處理后突變體中HrpNEa誘導(dǎo)抗蟲(chóng)效果兩方面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，篩選到一個(gè)感興趣的轉(zhuǎn)錄因子AtMYB44，參與調(diào)控HrpNEa誘導(dǎo)的擬南芥抗蟲(chóng)性。
　　 五、AtMYB44通過(guò)作用于乙烯信號(hào)傳導(dǎo)因子EIN2調(diào)控?cái)M南芥對(duì)桃蚜的誘導(dǎo)抗性
　　 AtMYB44是擬

13、南芥的一種轉(zhuǎn)錄因子，可以對(duì)乙烯發(fā)生感應(yīng)，從而介入植物防衛(wèi)反應(yīng)。植物防衛(wèi)反應(yīng)經(jīng)常受乙烯信號(hào)傳導(dǎo)支配，而乙烯信號(hào)需要EIN2作為中心調(diào)控因子才能完成傳導(dǎo)。我們以前研究表明EIN2在HrpNEa誘導(dǎo)擬南芥對(duì)蚜蟲(chóng)產(chǎn)生防衛(wèi)反應(yīng)的過(guò)程中起關(guān)鍵作用，但AtMYB44調(diào)控的靶標(biāo)及EIN2的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)理都還不清楚。在HrpNEa處理Col-0后，植物乙烯含量升高，蚜蟲(chóng)趨避且蚜蟲(chóng)繁殖受到抑制。但是在atmyb44突變體中，HrpNEa雖然能夠誘導(dǎo)乙烯含量升

14、高，但是不能誘導(dǎo)蚜蟲(chóng)趨避效應(yīng)和抑制蚜蟲(chóng)繁殖。外源乙烯作用與HrpNEa作用效果相同。遺傳學(xué)及藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究表明，乙烯和AtMYB44對(duì)于HrpNEa誘導(dǎo)擬南芥抗蟲(chóng)互為必需。在Col-0中，EIN2能夠被誘導(dǎo)表達(dá)，但是在atmyb44突變體中不能，在回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)材料中EIN2的表達(dá)情況與在Col-0中類(lèi)似。因此，EIN2誘導(dǎo)表達(dá)需要AtMYB44。將AtMYB44原核表達(dá)并部分純化用于GMSA實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明AtMYB44能與EIN2的啟動(dòng)子序

15、列體外特異性結(jié)合。用atmyb44得到遺傳互補(bǔ)的轉(zhuǎn)基因植物Mgh/m提取核蛋白用于GMSA實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明AtMYB44與EIN2啟動(dòng)子發(fā)生特異結(jié)合。用HrpNEa處理Col-0和Mgh/m植株，既促進(jìn)了AtMYB44蛋白的產(chǎn)生，也提高了AtMYB44與EIN2互作的能力，還增強(qiáng)了EIN2的表達(dá)水平。Co1-0和Mgh/m植株不受HrpNEa誘導(dǎo)的條件下，人工定殖的蚜蟲(chóng)可以誘導(dǎo)這兩類(lèi)植物表達(dá)AtMYB44和EIN2基因，同時(shí)誘導(dǎo)這兩類(lèi)植物

16、對(duì)第二次定殖的蚜蟲(chóng)產(chǎn)生抗蚜性反應(yīng)，而基因表達(dá)與抗蟲(chóng)反應(yīng)在atmyb44體內(nèi)均不能被蚜蟲(chóng)所誘導(dǎo)。這些試驗(yàn)結(jié)果表明，AtMYB44通過(guò)啟動(dòng)EIN2的表達(dá)來(lái)控制擬南芥對(duì)蚜蟲(chóng)的抗性。這一調(diào)控過(guò)程無(wú)論對(duì)誘導(dǎo)抗性還是免疫反應(yīng)均顯示功能，代表了植物抵抗植食性昆蟲(chóng)的一種重要防衛(wèi)機(jī)制。
　　 六、創(chuàng)新點(diǎn)
　　 1.實(shí)驗(yàn)闡述了水稻細(xì)條斑病菌產(chǎn)生的harpin蛋白HpaGx00c不同結(jié)構(gòu)域與功能的關(guān)系。挑選出來(lái)的三個(gè)片段HpaG1-g4、Hp

17、aG10-42、HpaG62-137分別在促進(jìn)植物生長(zhǎng)、誘導(dǎo)抗病和誘導(dǎo)過(guò)敏性細(xì)胞死亡方面表現(xiàn)最為突出。其中，HpaG10-42促進(jìn)植物生長(zhǎng)、誘導(dǎo)植物抗病性，但是不誘導(dǎo)肉眼可見(jiàn)的過(guò)敏性細(xì)胞死亡，為高效重組表達(dá)HpaGxooc蛋白提供理論基礎(chǔ)。將HpaG10-42應(yīng)用在水稻田間，效果好于全長(zhǎng)片段HpaGXooc，且與化學(xué)農(nóng)藥效果相當(dāng)，能夠誘導(dǎo)抗病性，并最終使稻米產(chǎn)量增加。
　　 2.研究明確EIN2介導(dǎo)植物韌皮部防衛(wèi)反應(yīng)，并在Hrp