何首烏飲對衰老大鼠生精細胞胰島素通路IRSI、IGF-1、IGFBP3基因表達的影響.pdf

1、目的：探討何首烏飲對衰老大鼠生精細胞胰島素信號通路IRS1、IGF-1、IGFBP3基因表達的影響。
　　方法：
　　一、體內(nèi)實驗
　　1．實驗分組及處理選用30只清潔級12月齡Wistar雄性大鼠隨機分為：青年對照組(YCG)，自然衰老組(NAG)，何首烏飲組(SWYG)，每組各10只。青年對照組適應性飼養(yǎng)一周后取材；自然衰老組在飼養(yǎng)到16月齡后灌胃等量蒸餾水60d；何首烏飲組在飼養(yǎng)到16月齡后，灌胃何首烏飲(4.8

2、g/100g)60d；自然衰老組和何首烏飲組均于18月齡時取材，備用。
　　2．觀察睪丸組織IRS1、IGF-1、IGFBP3基因表達采用免疫熒光染色觀察IRS1、IGF-1、IGFBP3在睪丸組織的表達位置，Western blot和實時熒光定量PCR檢測睪丸組織IRS1、IGF-1、IGFBP3蛋白和mRNA表達的變化。
　　二、體外實驗
　　1．細胞的分離、純化、培養(yǎng)和鑒定組合酶法分離細胞，Percoll梯度密度

3、離心和差異貼壁法純化細胞，利用蘇丹Ⅳ染液鑒定支持細胞并計算支持細胞的純度；分別利用堿性磷酸酶染色、孚耳根染色、HE染色鑒定生精細胞。
　　2．衰老模型的建立將培養(yǎng)至7d的生精細胞，加入終濃度為50μmol/L的H2O2和100μmol/L FeSO4，連續(xù)干預8h，換液，繼續(xù)培養(yǎng)72h；采用β-半乳糖甘酶特異性染色試劑盒檢測實驗各組中生精細胞β-半乳糖甘酶的表達情況，以判斷衰老模型是否建立成功。
　　3．實驗分組及處理根據(jù)實

4、驗目的分為：正常對照組(NCG)，將培養(yǎng)至7d的生精細胞，繼續(xù)培養(yǎng)80h；衰老模型組(AMG)，將培養(yǎng)至7 d的生精細胞，加入終濃度為50μmol/L的H2O2和100μmol/L的FeSO4，連續(xù)干預8h，換液，繼續(xù)培養(yǎng)72h；何首烏飲組(SWYG)，將培養(yǎng)至7d的生精細胞，加入終濃度分別為50μmol/L的H2O2和100μmol/L FeSO4，連續(xù)干預8h，換液，加入終濃度為10％的何首烏飲含藥血清，繼續(xù)培養(yǎng)72h。
　　

5、4．采用Western blot和實時熒光定量PCR檢測基因IRS1、IGF-1、IGFBP3在生精細胞的蛋白表達變化以及其mRNA的相對表達水平。
　　結(jié)果：
　　一、體內(nèi)實驗結(jié)果
　　1.免疫熒光檢測結(jié)果IRS1陽性產(chǎn)物發(fā)紅色熒光，定位在細胞膜，細胞核采用DAPI染色呈藍色，IRS1陽性產(chǎn)物主要表達在精母細胞、支持細胞和肌樣細胞。與青年對照組相比，自然衰老組IRS1陽性率明顯降低(P＜0.01)，何首烏飲干預后，與

6、自然衰老組相比，何首烏飲用藥組IRS1陽性率明顯升高(P＜0.01)。IGF-1陽性產(chǎn)物發(fā)綠色熒光，定位在細胞質(zhì)，細胞核采用DAPI染色呈藍色，IGF-1陽性產(chǎn)物主要表達在精子細胞。與青年對照組相比，自然衰老組IGF-1陽性率明顯降低(P＜0.01)，何首烏飲干預后，與自然衰老組相比，何首烏飲用藥組IGF-1陽性率明顯升高(P＜0.01)。IGFBP3陽性產(chǎn)物發(fā)綠色熒光，定位在細胞質(zhì)，細胞核采用 DAPI染色呈藍色，IGFBP3陽性產(chǎn)物

7、在精原細胞和少量間質(zhì)細胞均有表達。經(jīng)統(tǒng)計分析，與青年對照組相比，自然衰老組IGFBP3陽性率明顯升高(P＜0.01)，何首烏飲干預后，與自然衰老組相比，何首烏飲用藥組陽性率明顯降低(P＜0.01)。
　　2.Western blot檢測結(jié)果結(jié)果顯示，與青年對照組相比，自然衰老組IGFBP3表達明顯增加(P＜0.01)，IRS1、IGF-1表達明顯減少(P＜0.01)；與自然衰老組相比，何首烏飲用藥組IGFBP3表達量明顯減少(P＜

8、0.01)，IRS1、IGF-1表達量明顯增加(P＜0.01)。
　　3.qRT-PCR檢測結(jié)果結(jié)果顯示，與青年對照組相比，自然衰老組IGFBP3 mRNA表達明顯上調(diào)(P＜0.01)，IRS1、IGF-1的表達明顯下調(diào)(P＜0.01)；與自然衰老組相比，何首烏飲用藥組IGFBP3表達明顯下調(diào)(P＜0.01)，IRS1、IGF-1的表達明顯上調(diào)(P＜0.01)。
　　以上結(jié)果表明，何首烏飲可以通過調(diào)節(jié)胰島素信號通路關鍵基因

9、IRS1、IGF-1、IGFBP3的表達延緩大鼠睪丸組織的衰老，為了進一步分析何首烏飲對衰老大鼠生精功能的調(diào)控機制，我們采用支持細胞和生精細胞共培養(yǎng)的方法，檢測基因IRS1、IGF-1、IGFBP3在生精細胞的表達變化。
　　二、體外實驗結(jié)果：
　　1.蘇丹Ⅳ染色結(jié)果顯示支持細胞純度可達90%以上。
　　2.β-半乳糖甘酶特異性染色結(jié)果β-半乳糖甘酶特異性染色結(jié)果顯示，β-半乳糖苷酶陽性產(chǎn)物定位在生精細胞質(zhì)中。衰老模型

10、組β-半乳糖苷酶陽性率明顯高于正常對照組（P＜0.01）；何首烏飲含藥血清干預后，與衰老模型組相比，何首烏飲組陽性率明顯降低（P＜0.01）。
　　3.Western blot檢測結(jié)果Western blot檢測生精細胞IRS1、IGF-1、IGFBP3蛋白表達結(jié)果顯示，與正常對照組相比，衰老模型組IRS1、IGF-1表達下調(diào)，IGFBP3表達上調(diào)(P＜0.01)，何首烏飲含藥血清干預后，與衰老模型組相比，何首烏飲組IRS1、IG

11、F-1表達上調(diào)，IGFBP3表達下調(diào)(P＜0.01)。
　　4.qRT-PCR檢測結(jié)果 qRT-PCR檢測生精細胞IRS1、IGF-1、IGFBP3在 mRNA水平的改變，與正常對照組相比，衰老模型組IRS1、IGF-1的表達明顯下調(diào)(P＜0.01)，IGFBP3的表達上調(diào)(P＜0.01)；何首烏飲含藥血清干預以后，與衰老模型組相比較，IRS1、IGF-1的表達明顯上調(diào)(P＜0.01)，IGFBP3的表達有所下調(diào)(P＜0.01)。

12、
　　結(jié)論：
　　1.何首烏飲可以通過提高衰老大鼠睪丸組織胰島素通路關鍵基因IRS1、IGF-1的表達，抑制IGFBP3的表達，延緩大鼠睪丸組織的衰老。
　　2.何首烏飲能夠降低衰老標志物β-半乳糖苷酶在生精細胞的表達。
　　3.何首烏飲可以通過促進生精細胞胰島素通路關鍵基因IRS1、IGF-1的表達，抑制IGFBP3的表達，延緩大鼠生精細胞的衰老。
　　綜上所述，何首烏飲通過調(diào)節(jié)胰島素信號通路關鍵基因IR