骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基上調(diào)Smad6的表達(dá),抑制BMP-4-Smad1-5-8通路.pdf

1、目的：根據(jù)目前大宗流行病學(xué)調(diào)查顯示，脊髓損傷的發(fā)病率有著逐漸升高的趨勢(shì)，而治療脊髓損傷的策略卻十分有限，往往不能獲得令人滿(mǎn)意的效果。近些年來(lái)，越來(lái)越多的學(xué)者開(kāi)始研究干細(xì)胞作為材料用來(lái)治療脊髓損傷，在動(dòng)物模型及臨床初步試驗(yàn)之前，就要求先在體外實(shí)驗(yàn)中探索神經(jīng)干細(xì)胞在多種條件下的分化過(guò)程，盡可能的去模擬脊髓損傷后的微環(huán)境的變化，以提高干細(xì)胞研究的效率。因此我們的目的是探索在神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）分化過(guò)程中，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基(BMSC

2、-CM)對(duì)骨形態(tài)發(fā)生蛋白－4(BMP-4)誘導(dǎo)的Smad信號(hào)通路的影響。
　　方法：在實(shí)驗(yàn)研究過(guò)程中，從24h新生SD幼鼠大腦組織提取神經(jīng)干細(xì)胞，并且從SD大鼠中提取了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，分別進(jìn)行增殖培養(yǎng)，隨后使用免疫熒光化學(xué)染色法及流式細(xì)胞術(shù)分別對(duì)二者進(jìn)行鑒定，按照標(biāo)準(zhǔn)的方法獲取了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基（BMSC-CM），然后在不同的條件下進(jìn)行分化培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞，設(shè)計(jì)了四個(gè)實(shí)驗(yàn)組，分別為：對(duì)照組，BMP-4處理組，BMSC-C

3、M處理組，BMP-4和BMSC-CM共處理組。我們使用了免疫熒光化學(xué)細(xì)胞染色技術(shù)以及WB的技術(shù)檢測(cè)了微管相關(guān)蛋白-2(MAP-2)以及星型膠質(zhì)纖維蛋白(GFAP)的表達(dá)水平，Ⅱ型以及Ⅰa型骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體的表達(dá)量由WB技術(shù)檢測(cè)，并且Smad6，Smad1/5/8及REST mRNA的表達(dá)量由實(shí)時(shí)定量PCR(Q-RT-PCR)進(jìn)行檢測(cè)。
　　結(jié)果：培養(yǎng)的細(xì)胞經(jīng)免疫熒光化學(xué)染色及流式細(xì)胞術(shù)分別鑒定后證實(shí)了二者分別為神經(jīng)干細(xì)胞及骨髓間

4、充質(zhì)干細(xì)胞，WB實(shí)驗(yàn)結(jié)果中顯示骨形態(tài)發(fā)生蛋白-4（BMP-4）處理組中 MAP-2的表達(dá)量低于對(duì)照組，并且在免疫熒光實(shí)驗(yàn)中顯示BMP-4組中神經(jīng)元的生成有所減少，星型膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量增多；與空白對(duì)照組相比，BMSC-CM處理組中MAP-2的表達(dá)增加，相反GFAP的表達(dá)下降。而在共處理組中，MAP-2的表達(dá)量高于BMP-4處理組，低于BMSC-CM處理組，GFAP的表達(dá)量則相反。我們從結(jié)果中還發(fā)現(xiàn)了BMSC-CM能夠下調(diào)BMPRⅡ和BMPR

5、Ⅰa的表達(dá)，進(jìn)而抑制了 BMP信號(hào)通路的激活。而且，BMSC-CM能夠上調(diào) Smad6 mRNA的表達(dá)，下調(diào)Smad1/5/8 mRNA及REST mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)論：通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的觀察，揭示了 BMSC-CM能夠通過(guò)上調(diào) Smad6的表達(dá)來(lái)中和BMP-4對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞分化的影響；抑制BMP-4-Smad1/5/8-REST信號(hào)通路來(lái)下調(diào) GFAP的表達(dá)，并且能夠增加神經(jīng)元的生成，由此可見(jiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基（BMSC-