原發(fā)免疫性血小板減少癥氣不攝血證病證結(jié)合小鼠模型研究.pdf

1、原發(fā)免疫性血小板減少癥（Primary immune thrombocytopenia，ITP）是一種以血小板減少、伴或不伴皮膚粘膜瘀紫、鼻衄、內(nèi)臟出血等為特征的自身免疫性疾病，ITP動(dòng)物模型是深入研究ITP發(fā)病機(jī)制與治療方法的主要手段，在ITP的研究中發(fā)揮著重要作用。病證結(jié)合動(dòng)物模型是開(kāi)展中醫(yī)藥治療ITP作用機(jī)制研究的重要基礎(chǔ)，目前ITP的病證結(jié)合模型主要有ITP熱盛證模型、ITP腎陰虛證模型、ITP氣不攝血證模型等，但氣不攝血證IT

2、P動(dòng)物模型的研究還比較少，因此，本文在以往研究的基礎(chǔ)上，采用病證結(jié)合動(dòng)物模型擬臨床研究的方法，建立ITP氣不攝血證病證結(jié)合小鼠模型，并對(duì)該模型的病理生理機(jī)制進(jìn)行了動(dòng)態(tài)觀察，以期為中醫(yī)氣血理論理論研究及中藥藥效評(píng)價(jià)提供一種合適的動(dòng)物模型。
　　目的:
　　1)本課題采用動(dòng)物模型對(duì)照法，比較分析法建立ITP氣不攝血證病證結(jié)合模型。
　　2)通過(guò)對(duì)ITP氣不攝血證病證結(jié)合模型成模過(guò)程中生理病理指標(biāo)的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)與比較探索氣不攝血

3、證的生理病理分子層面的發(fā)病機(jī)制。
　　3)通過(guò)模型臨床指標(biāo)的監(jiān)控與臨床疾病發(fā)生的對(duì)比，比較分析出合理的合乎臨床的氣不攝血證模型。
　　內(nèi)容與方法:
　　1.小鼠氣虛模型的建立與評(píng)價(jià)
　　將ICR雄性小鼠分為正常對(duì)照組、睡眠剝奪組、力竭游泳組、睡眠剝奪+力竭游泳（簡(jiǎn)稱(chēng)復(fù)合組），每組12只，睡眠剝奪組采用每天9小時(shí)水環(huán)境多平臺(tái)法進(jìn)行睡眠剝奪;力竭游泳組采用負(fù)重游泳力竭;復(fù)合組采用兩種方法聯(lián)合使用，連續(xù)4周。觀察小鼠行

4、為，測(cè)量體重、抓力，數(shù)碼照相機(jī)采集舌面，舌底脈絡(luò)，足部圖像，小動(dòng)物無(wú)創(chuàng)監(jiān)護(hù)儀檢測(cè)脈搏信號(hào)，細(xì)胞流式儀檢測(cè)脾臟B細(xì)胞與T細(xì)胞亞群。
　　2.小鼠原發(fā)免疫性血小板減少癥模型的建立
　　將CBA/J雌性小鼠分為正常組與模型組，每組5只。模型組采用腹腔注射哺乳期后雌性Wistar大鼠血小板進(jìn)行免疫造模，腹腔注射0.5ml含1×108個(gè)大鼠血小板的0.9％氯化鈉溶液首次免疫，之后每周一次注射0.5×108個(gè)血小板強(qiáng)化免疫，正常組腹腔注

5、射生理鹽水，連續(xù)注射4周。每周免疫注射前，小鼠行尾尖取血測(cè)量血小板數(shù)。
　　3.小鼠原發(fā)免疫性血小板減少癥氣不攝血證病證結(jié)合模型的建立與評(píng)價(jià)
　　將CBA/J雌性小鼠分為正常組、睡眠剝奪組、免疫組、睡眠剝奪-免疫組，益氣攝血方組，每組12只。睡眠剝奪組采用每天16時(shí)水環(huán)境多平臺(tái)睡眠剝奪法;免疫組采用腹腔注射哺乳期后Wistar雌性大鼠血小板進(jìn)行免疫造模;睡眠剝奪-免疫組兩種方法聯(lián)合使用;中藥組與睡眠剝奪-免疫組干預(yù)一致，并每

6、天灌胃益氣攝血方，連續(xù)35天。觀察小鼠行為，測(cè)量體重與抓力，數(shù)碼照相機(jī)采集小鼠舌面圖像，小動(dòng)物無(wú)創(chuàng)監(jiān)護(hù)儀檢測(cè)脈搏信號(hào)，稱(chēng)量脾臟指數(shù)，胸腺指數(shù);細(xì)胞流式儀檢測(cè)脾臟B細(xì)胞與T細(xì)胞亞;HE法觀察脾臟病理，血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)血小板數(shù); ELISA檢測(cè)血清細(xì)胞因子。
　　4.小鼠原發(fā)免疫性血小板減少癥氣不攝血證病證結(jié)合模型的動(dòng)態(tài)研究
　　將CBA/J雌性小鼠分為正常組、模型組，每組48只。模型組采用多平臺(tái)水環(huán)境法進(jìn)行睡眠剝奪，每天16小

7、時(shí)，并在第二周結(jié)合腹腔注射哺乳期后Wistar雌性大鼠血小板進(jìn)行ITP病癥結(jié)合造模。正常組與模型組分別在第2、3、4、5周末取材。觀察小鼠行為與體重，抓力儀測(cè)量小鼠抓力，數(shù)碼照相機(jī)采集舌面，舌底脈絡(luò)，足部圖像，小動(dòng)物無(wú)創(chuàng)監(jiān)護(hù)儀檢測(cè)脈搏信號(hào)，稱(chēng)量脾臟指數(shù)，胸腺指數(shù);細(xì)胞流式儀檢測(cè)脾臟B細(xì)胞與T細(xì)胞亞群;HE法觀察脾臟病理，血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)血小板數(shù);ELISA檢測(cè)血清細(xì)胞因子。
　　結(jié)果:
　　1.小鼠氣虛模型的建立與評(píng)價(jià)

8、>　　1)主要癥狀:與正常對(duì)照組比較，三組模型小鼠呈現(xiàn)疲勞特性，體重、抓力顯著降低(P＜0.05-0.01)。
　　2)舌像:模型組小鼠舌面呈現(xiàn)不同程度的變白，只有復(fù)合組具有顯著性差異(P＜0.05)。
　　3)脈象:復(fù)合組與睡眠剝奪組小鼠心率、脈搏幅度、呼吸頻率、與呼吸幅度均顯著降低（P＜0.05-0.01）。
　　4)免疫學(xué):各模型組的CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞亞群顯著增加(P＜0.01)，睡眠剝奪組的CD

9、19+B細(xì)胞數(shù)目顯著減少(P＜0.01)。
　　2.小鼠原發(fā)免疫性血小板減少癥模型的建立
　　1)與正常對(duì)照組比較，模型組血小板數(shù)目在第2周達(dá)到最低點(diǎn)，結(jié)果有顯著差異(P＜0.01)。
　　3.小鼠原發(fā)免疫性血小板減少癥氣不攝血證病證結(jié)合模型的建立與評(píng)價(jià)
　　1)主要癥狀:與正常組比較，各模型組小鼠活動(dòng)能力均降低，體重、抓力顯著降低(P＜0.05-0.01)呈現(xiàn)疲勞狀態(tài)。
　　2)舌像:小鼠舌面均出現(xiàn)不同程

10、度的變嫩白。
　　3)脈象:各組的血氧飽和度均明顯下降(P＜0.01-0.05)，睡眠剝奪組，免疫組，睡眠剝奪-免疫組心率值下降，而藥物組心率值升高，睡眠剝奪組呼吸頻率升高(P＜0.05)，其余組無(wú)明顯變化(P＞0.05)，睡眠剝奪-免疫組脈搏幅度明顯降低(P＜0.05)，其余組無(wú)明顯差異(P＞0.05)。
　　血液學(xué):模型組巨核細(xì)胞成熟障礙，并且出現(xiàn)凋亡小體。
　　4)藥物組在前3周血小板數(shù)升高明顯(P＜0.05)，

11、在4，5周時(shí)睡眠剝奪-免疫組血小板數(shù)最低(P＜0.01)。
　　5)免疫學(xué):各組脾臟指數(shù)均降低（P＜0.05-0.01），睡眠剝奪組，睡眠剝多-免疫組胸腺指數(shù)降低，差異明顯(P＜0.01-0.05)。
　　各組的CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞亞群明顯增加(P＜0.01)，睡眠剝奪組的CD19+B細(xì)胞明顯減少(P＜0.01)。
　　6)小鼠血小板相關(guān)抗體PAIgA與PAIgM無(wú)明顯差異。
　　7)血清細(xì)胞因子各

12、組分泌的IL-6均高于正常組(P＜0.01)，以睡眠剝奪-免疫組差異最大，各組IFN-γ/IL-4比值均變大。
　　4.小鼠原發(fā)免疫性血小板減少癥氣不攝血證病證結(jié)合模型的動(dòng)態(tài)研究
　　1)主要癥狀:與正常對(duì)照組比較，各組模型小鼠體重、抓力顯著降低(P＜0.05-0.01)，呈現(xiàn)疲勞特性。
　　2)舌像:模型組小鼠舌面均出現(xiàn)不同程度的變嫩白。
　　3)脈象:模型組在第3，4周心率高于正常組(P＜0.01)在第3周之

13、后，脈搏幅度明顯低于正常組(P＜0.01)。
　　4)血液學(xué):模型組巨核細(xì)胞成熟障礙，且在第5周差異最大。
　　5)在第1-2周，模型組血小板數(shù)目高于正常組，差異明顯(P＜0.01-0.05)，在第3-5周，模型組血小板數(shù)目低于正常組，差異明顯(P＜0.01)，在第4周血小板數(shù)降低至最低。
　　6)免疫學(xué):模型組脾臟指數(shù)與胸腺指數(shù)動(dòng)態(tài)觀察均低于正常組，其中以在第2，3周時(shí)差異顯著(P＜0.05)。
　　7)模型組

14、各周次的T細(xì)胞亞群CD3+、CD4+、CD8+明顯增加(P＜0.01)，在第4，5周CD4+/CD8+明顯高于正常組(P＜0.01)，模型組的CD19+B細(xì)胞顯著減少(P＜0.01)。
　　8)模型組小鼠血小板相關(guān)抗體PAIgA，PAIgG比正常組高。隨造模時(shí)間增長(zhǎng)，差異增大，在第5周時(shí)PAIgG差異明顯(P＜0.05)。
　　9)血清細(xì)胞因子模型組分泌的IL-6均高于正常組，差異明顯(P＜0.05)，IFN-γ/IL-4比

15、值大于正常組，在第3，4周差異顯著(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.睡眠剝奪，力竭游泳，睡眠剝奪+力竭游泳三種方法均可以成功制備氣虛小鼠模型，以睡眠剝奪造模最優(yōu)。
　　2.基于免疫學(xué)的抗原交叉模擬原理，通過(guò)提取哺乳期后Wistar雌性大鼠血小板，腹腔注射進(jìn)CBA雌性小鼠體內(nèi)可模擬臨床慢性ITP疾病，以實(shí)驗(yàn)2-3周為最佳。
　　3.睡眠剝奪結(jié)合血小板免疫5周，可以制備一種ITP氣不攝血證病證結(jié)合模型，為后續(xù)研