表觀遺傳修飾增加兩株滸苔真菌的化學(xué)多樣性研究.pdf

1、表觀遺傳修飾學(xué)是研究 DNA序列沒有發(fā)生變化的可遺傳的基因表達(dá)的改變。近年發(fā)現(xiàn),真核生物的組蛋白乙?；?、DNA去甲基化和染色質(zhì)去壓縮狀態(tài)可促進(jìn)基因活化、提高基因轉(zhuǎn)錄子的啟動。因此這種思路被引用到真核微生物真菌沉默基因的激活和基因表達(dá)上。
　　為了激活海洋真菌沉默基因的表達(dá),從其發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)新的具有生物活性的次生代謝產(chǎn)物,本論文對31株分自青島海域滸苔樣品的真菌進(jìn)行了篩選,對每株菌株采用DNA甲基化酶抑制劑和組蛋白去乙?；敢种苿┻M(jìn)

2、行調(diào)節(jié),并對其發(fā)酵后得到的萃取物使用 TLC/HPLC化學(xué)篩選與抗腫瘤生物活性篩選相結(jié)合的組合生物學(xué)篩選模式進(jìn)行篩選。最終篩選出代謝產(chǎn)物種類變化豐富生物活性顯著提高的2株菌株進(jìn)行進(jìn)一步的研究。
　　通過添加DNA甲基化酶抑制劑和組蛋白去乙?；敢种苿┖Y選出代謝產(chǎn)物種類變化豐富生物活性顯著提高的2株菌株進(jìn)行發(fā)酵,并分別在自然條件下發(fā)酵該兩株菌株,分別萃取獲得4份發(fā)酵產(chǎn)物。利用常規(guī)加壓/減壓硅膠柱色譜、凝膠柱色譜以及 HPLC高效液相

3、色譜法等分離手段分別對發(fā)酵萃取物進(jìn)行化合物的分離純化及鑒定,共獲得41個單體化合物(Fig.0-1)。
　　綜合利用紅外光譜(IR)、紫外光譜(UV)、質(zhì)譜(MS)、核磁(NMR)、比旋光(OR)、圓二色譜(CD)等方法確定了化合物的結(jié)構(gòu)。其中從菌株Aspergillus terreus OUCMDZ-2739不添加抑制劑培養(yǎng)條件下分離鑒定化合物7個(1–7),均為已知化合物。從其添加組蛋白去乙?；敢种苿┣乓志谹(TSA)調(diào)

4、節(jié)的發(fā)酵萃取物中分離得到差異化合物18個(8–25),其中新化合物9個,差異類型化合物5類。從菌株P(guān)enicillium sp. OUCMDZ-770不添加抑制劑培養(yǎng)條件下分離鑒定化合物8個(26–33),新化合物2個。從其添加組蛋白去乙?；敢种苿┍焖徕c(VPA)調(diào)節(jié)的發(fā)酵萃取物中分離得到差異化合物8個(34–41),其中新化合物1個,差異類型化合物4類。
　　對從Aspergillus terreus OUCMDZ-2739

5、中所分離鑒定的化合物進(jìn)行了常見致病菌的抑菌活性測試和對多種腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒活性測試。結(jié)果表明:化合物8、12、21對大腸桿菌有弱的抑制活性,MIC分別為25μg/mL、50μg/mL、50μg/mL。
　　對從Penicillium sp. OUCMDZ-770中所分離鑒定的化合物進(jìn)行了常見致病菌的抑菌活性測試和對多種腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒活性測試。結(jié)果表明:化合物30、32、41對A549細(xì)胞有弱的抑制活性,IC50分別為18μM、2

6、1μM、28μM?；衔?6、41對Enterobacter aerogenes(產(chǎn)氣桿菌)表現(xiàn)出弱的抑制活性,MIC分別為50、30μg/mL。
　　海洋真菌微生物在常規(guī)實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下由高壓、高鹽、低溫、寡營養(yǎng)這些其獨(dú)特的生存環(huán)境導(dǎo)致其截然不同于陸生微生物的代謝途徑常處于抑制狀態(tài)而不能表達(dá)。本論文通過實(shí)驗(yàn)證明利用組蛋白去乙?；敢种苿￢PA、TSA調(diào)節(jié),可有效激活海洋真菌實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)條件下沉默基因的表達(dá),進(jìn)而表現(xiàn)出其獨(dú)特的代謝途

7、徑,產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎種類不同于常規(guī)培養(yǎng)條件下的代謝產(chǎn)物。
　　本文研究內(nèi)容主要包括以下3個方面:
　　1.目標(biāo)菌株的篩選。對采自于青島海域的滸苔樣品中分離純化獲得的31株滸苔共附生真菌進(jìn)行表觀遺傳修飾的調(diào)控,針對每株真菌分別使用DNA甲基化酶抑制劑和組蛋白去乙?；敢种苿┻M(jìn)行調(diào)控,對每份發(fā)酵萃取物采用 TLC薄層色譜和 HPLC指紋圖譜作為化學(xué)檢測手段,并以抑菌試驗(yàn)、MCF-7腫瘤細(xì)胞增殖抑制等手段作為生物活性篩選模型,以化學(xué)和

8、生物活性評價相結(jié)合的集成篩選模式,篩選代謝產(chǎn)物種類多樣性變化豐富、生物活性顯著提高的菌株作為目標(biāo)菌株,最終通過集成篩選獲得2株菌株作為研究目標(biāo)。
　　2.表觀遺傳修飾調(diào)控對兩株滸苔來源真菌次生代謝產(chǎn)物影響的研究。對次生代謝產(chǎn)物變化豐富生物活性顯著提高的2株滸苔來源真菌分別進(jìn)行不添加抑制劑培養(yǎng)條件和添加抑制劑進(jìn)行調(diào)節(jié)的發(fā)酵條件進(jìn)行規(guī)模發(fā)酵,分別對4份發(fā)酵萃取物進(jìn)行分離鑒定,通過對比得到表觀遺傳修飾策略高效性的結(jié)論。通過TLC薄層色譜

9、、正相/反相/加壓/減壓硅膠柱色譜、Sephadex LH-20凝膠柱色譜、HPLC反相高效液相色譜等實(shí)驗(yàn)室常規(guī)分離方法,從不添加抑制劑培養(yǎng)條件和添加組蛋白去乙?；敢种苿┑呐囵B(yǎng)條件下的發(fā)酵萃取物中共分離得到41個單體化合物;應(yīng)用紫外光譜UV,紅外光譜IR,核磁共振波譜NMR,質(zhì)譜MS等波譜解析技術(shù)鑒定了41個單體化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)(Fig.0-1),其中新化合物12個。從菌株Aspergillus terreus OUCMDZ-2739

10、不添加抑制劑培養(yǎng)條件下分離鑒定化合物7個(1–7),均為已知化合物,包含五個二苯基-γ-丁內(nèi)酯類化合物(1–5)、一個氨基酸途徑來源化合物(6)和一個聚酮途徑來源化合物(7)。從其添加組蛋白去乙?；敢种苿┣乓志?A(TSA)調(diào)節(jié)的發(fā)酵萃取物中分離得到差異化合物18個(8–25),其中新化合物9個,差異類型化合物5類。包括四個新生物合成途徑來源化合物(8–11)、一個環(huán)外雙鍵γ-丁內(nèi)酯類化合物(13)、四個呋喃二酮類化合物及其衍生物

11、(15–18)、兩個苯并內(nèi)酯類化合物(21、22)、兩個萜類化合物(23、24)和兩個其他類化合物(12、14)。從菌株P(guān)enicillium sp. OUCMDZ-770不添加抑制劑培養(yǎng)條件下分離鑒定化合物8個(26–33),新化合物2個(26、27)。該菌在不添加抑制劑培養(yǎng)條件下得到了7個二酮哌嗪類環(huán)二肽(26、28–33)。從其添加組蛋白去乙?；敢种苿┍焖徕c(VPA)調(diào)節(jié)的發(fā)酵萃取物中分離得到差異化合物8個(34–41),其中

12、新化合物1個,差異類型化合物3類。包括3個二酮哌嗪衍生物(34、35、40)、2個α,β不飽和內(nèi)酰胺類化合物(36、37)、一個二萜類化合物(38)、一個聚酮途徑來源化合物(39)、一個苯并噻唑(41)。運(yùn)用體外生物活性篩選模型,初步評價了單體化合物的腫瘤細(xì)胞增殖抑制活性和抑菌活性。其中化合物8、12、21對大腸桿菌有弱的抑制活性,MIC分別為25μg/mL、50μg/mL、50μg/mL。化合物30、32、41對A549細(xì)胞有弱的抑制

13、活性, IC50分別為18μM、21μM、28μM?；衔?6、41對Enterobacter aerogenes(產(chǎn)氣桿菌)表現(xiàn)出弱的抑制活性,MIC分別為50、30μg/mL。
　　3.初步探討了表觀遺傳修飾策略對激活海洋來源真菌沉默基因、促進(jìn)特殊代謝途徑的表達(dá)進(jìn)而對次生代謝產(chǎn)物化學(xué)多樣性的影響。通過對比TLC、HPLC指紋圖譜初步闡明了組蛋白去乙酰化酶抑制劑 VPA和 TSA分別對菌株Aspergillus terreus

14、OUCMDZ-2739、Penicillium sp. OUCMDZ-770次生代謝產(chǎn)物的影響;通過生物活性測試找到了添加組蛋白去乙?；敢种苿㏕SA和VPA后導(dǎo)致發(fā)酵萃取物生物活性提高的化合物所在。
　　綜上所述,通過對兩株滸苔來源真菌分別添加組蛋白去乙?；敢种苿㏕SA和VPA后對其次生代謝產(chǎn)物影響的系統(tǒng)研究,證明表觀遺傳修飾策略可有效激活真菌中沉默基因的表達(dá),提高菌株次生代謝產(chǎn)物的化學(xué)多樣性,同時產(chǎn)生新的活性代謝產(chǎn)物,進(jìn)而為