細(xì)胞衰老與自噬相關(guān)因子在骨髓增生異常綜合征惡性進(jìn)展和預(yù)后評(píng)估中的作用研究.pdf

1、第一部分細(xì)胞衰老相關(guān)因子在骨髓增生異常綜合征惡性進(jìn)展和預(yù)后評(píng)估中的作用研究
　　目的：
　　骨髓增生異常綜合征（Myelodysplastic syndromes，MDS）是起源于骨髓造血干細(xì)胞的異質(zhì)性克隆性疾病，具有向急性髓系白血病演變的高風(fēng)險(xiǎn)。本實(shí)驗(yàn)旨在研究細(xì)胞衰老相關(guān)因子p16INK4a和β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）等在骨髓增生異常綜合征患者惡性進(jìn)展及預(yù)后評(píng)估中的作用，探討MDS的發(fā)病機(jī)制。
　　方法：

2、r>　　1.細(xì)胞衰老檢測(cè)：采用生物化學(xué)法進(jìn)行衰老生物學(xué)標(biāo)志β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)的染色檢查，光鏡下觀察，SA-β-gal陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞顯示藍(lán)色，隨機(jī)選取細(xì)胞分布均勻的5個(gè)高倍視野共500個(gè)細(xì)胞進(jìn)行觀察，計(jì)數(shù)SA-β-gal染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算染色陽(yáng)性細(xì)胞比率。
　　2.應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)患者P16INK4a和SA-β-gal等細(xì)胞衰老相關(guān)因子mRNA表達(dá)水平、衰老活性（53例MDS患者，11名對(duì)

3、照以及12例急性髓系白血病患者）。其中，磁珠分選患者骨髓CD34+細(xì)胞7例， CD34+細(xì)胞對(duì)照組3例，其余均為骨髓單個(gè)核細(xì)胞，分析臨床資料及MDS患者細(xì)胞衰老因子表達(dá)水平與WPSS評(píng)分、危險(xiǎn)度分組的關(guān)系。
　　3.采用western-blot及免疫熒光技術(shù)檢測(cè)患者p16mRNA蛋白表達(dá)，分析MDS患者蛋白表達(dá)水平與WPSS評(píng)分及危險(xiǎn)度分組的關(guān)系，進(jìn)行MDS惡性進(jìn)展和預(yù)后評(píng)估分析。
　　結(jié)果：
　　MDS組SA-β-g

4、al陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯高于對(duì)照組(p＜0.01)，AML組SA-β-gal陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯低于對(duì)照組(p＜0.05);在骨髓單個(gè)核細(xì)胞（BMMNCs）/CD34+細(xì)胞中， MDS患者 P16mRNA表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組。p16mRNA/abl MDS組為0.1477±0.1852，正常對(duì)照組為0.0709±0.0995，AML組為0.0086±0.0047。MDS組明顯高于正常對(duì)照組，P<0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。AML組 p16mRN

5、A水平明顯低于正常對(duì)照組,P<0.01,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在MDS病人中p16mRNA的表達(dá)率與WPSS評(píng)分成負(fù)相關(guān)（R2=-0.234）;應(yīng)用western blot檢測(cè)，陽(yáng)性對(duì)照HeLa細(xì)胞表達(dá)最強(qiáng)，MDS較強(qiáng)，AML表達(dá)最弱，MDS患者BMMNCs的p16INK4a蛋白表達(dá)比正常對(duì)照組明顯增高(P<0.05)；采用免疫熒光技術(shù)檢測(cè) MDS組、正常對(duì)照組及 AML組患者的p16INK4a蛋白表達(dá)情況。結(jié)果提示：MDS組、正常對(duì)照組至A

6、ML組p16INK4a蛋白表達(dá)水平逐漸下降，與p16INK4a mRNA表達(dá)趨勢(shì)基本一致。
　　結(jié)論：
　　MDS患者BMMNCs和CD34+細(xì)胞衰老水平升高；p16INK4a和SA-β-gal等衰老因子表達(dá)與WPSS積分、危險(xiǎn)度分組呈負(fù)相關(guān)，衰老因子表達(dá)水平與MDS患者預(yù)后負(fù)相關(guān)。在MDS的惡性進(jìn)展中有衰老機(jī)制的參與，P16INK4a-Rb信號(hào)通路的激活可能是細(xì)胞衰老的機(jī)制。
　　第二部分自噬相關(guān)因子在骨髓增生異常綜

7、合征惡性進(jìn)展和預(yù)后評(píng)估中的作用研究
　　目的：
　　本實(shí)驗(yàn)旨在研究自噬相關(guān)基因LC3B、Beclin1、UVRAG等在骨髓增生異常綜合征患者惡性進(jìn)展及預(yù)后評(píng)估中的作用，探討MDS的發(fā)病機(jī)制。
　　方法：
　　1.應(yīng)用透射電子顯微鏡檢測(cè)患者骨髓單個(gè)核細(xì)胞自噬情況。
　　2.實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測(cè)不同白血病細(xì)胞株、低危MDS組、高危MDS組、急性髓系白血病患者(De novo AML)及非惡性

8、病貧血（NM）患者LC3B、Beclin1、UVRAG、bcl-2等基因mRNA表達(dá)水平，分析臨床資料及MDS患者自噬因子表達(dá)水平與危險(xiǎn)度分組、WPSS評(píng)分的關(guān)系。
　　3.采用western-blot技術(shù)及免疫熒光技術(shù)檢測(cè)患者LC3B、Beclin1等蛋白表達(dá)，分析MDS患者蛋白表達(dá)水平與危險(xiǎn)度分組、WPSS評(píng)分的關(guān)系。
　　4.采用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)22例MDS患者、9例AML及17例NM患者骨髓CD34+細(xì)胞自噬

9、活性，并分析其與WPSS評(píng)分的關(guān)系。
　　5.化學(xué)合成靶向 Bcl-2基因的siRNA，脂質(zhì)體法將 siRNA轉(zhuǎn)染 HL-60細(xì)胞， RT-PCR檢測(cè)RNA干擾前后Bcl-2、LC3、Beclin-1mRNA、蛋白的表達(dá)水平，檢測(cè)自噬活性；MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖；流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期、凋亡率。
　　結(jié)果：
　　低危MDS患者BMMNCs內(nèi)易見(jiàn)自噬泡，顯示MDS患者BMMNCs含自噬泡數(shù)量顯著高于NM、AML組（P<0．

10、05）；NM組及低危MDS患者BMMNCs LC3B、UVRAG mRNA表達(dá)水平顯著高于高危MDS及AML組(P<0．05)，Beclin-1在低危MDS組高表達(dá)，而B(niǎo)cl-2在高危MDS和AML組高表達(dá)，二者在MDS中表達(dá)呈負(fù)相關(guān)；LC3B、Beclin-1及UVRAG mRNA表達(dá)水平與MDS患者危險(xiǎn)度分組、WPSS評(píng)分呈負(fù)相關(guān)。蛋白免疫印跡法顯示低危MDS患者BMMNCs LC3B、Beclin-1蛋白表達(dá)高于高危 MDS組及

11、AML組，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)；高危 MDS與 AML比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0．05)?；颊?CD34+細(xì)胞自噬活性檢測(cè)顯示，低危 MDS組高于高危MDS組及AML組(P<0.05)；骨髓CD34+細(xì)胞自噬活性與MDS患者危險(xiǎn)度分組、WPSS評(píng)分呈負(fù)相關(guān)。Bc1-2-siRNA轉(zhuǎn)染HL-60細(xì)胞后，細(xì)胞自噬因子表達(dá)升高，細(xì)胞凋亡增加，抑制了腫瘤細(xì)胞增殖。
　　結(jié)論：
　　低危MDS患者BMMNCs和CD34+細(xì)