骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞影響慢性粒細(xì)胞白血病K562細(xì)胞株增殖、凋亡及對伊馬替尼敏感性的研究.pdf

1、目的：
　　慢性粒細(xì)胞白血?。–hronic Myeloid Leukemia,CML）是一種起源于多能造血干細(xì)胞的惡性克隆增殖性疾病。其特點(diǎn)是存在能夠編碼具有較強(qiáng)酪氨酸激酶活性蛋白的 Ph染色體以及 Bcr-Abl融合基因。酪氨酸激酶抑制劑（Tyrosine Kinase Inhibitor,TKI）作為其靶向藥物，療效顯著。但是隨著疾病的進(jìn)展以及治療期的延長，另一嚴(yán)峻問題逐漸顯現(xiàn)—TKIs耐藥。骨髓微環(huán)境（Bone Marro

2、w Micro-environment）是造血干細(xì)胞生長發(fā)育的主要場所，與腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展及耐藥有著密不可分的聯(lián)系。間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal Stem Cells，MSCs）作為骨髓腫瘤微環(huán)境（tumor micro-environment）中的最重要的基質(zhì)細(xì)胞之一，在這過程中扮演重要角色。因此，我們在體內(nèi)外條件下研究CML患者來源骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BM-

3、MSCs）對慢性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞株K562增殖能力、凋亡水平及對伊馬替尼（Imatinib,IM）敏感性的影響，以初步探討B(tài)M-MSCs影響慢性粒細(xì)胞白血病進(jìn)展及耐藥的機(jī)制，為緩解、甚至逆轉(zhuǎn)CML對IM耐藥提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法：
　　收集CML患者骨髓標(biāo)本，利用密度梯度離心法結(jié)合貼壁分離篩選法提取 BM-MSCs，并通過 H-E染色進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定，通過傳代純化細(xì)胞。將BM-MSCs與K562細(xì)胞以不同比例接觸共培養(yǎng)，繪制

4、K562細(xì)胞生長曲線，并利用流式細(xì)胞術(shù)檢測K562細(xì)胞凋亡水平及所處細(xì)胞周期。將BM-MSCs與K562細(xì)胞種植于 BALB/C裸鼠右側(cè)腋窩皮下，觀察裸鼠皮下瘤成瘤情況，繪制生長曲線。皮下瘤形成2周后每日灌胃給藥IM，4周后處死裸鼠，計(jì)算體積抑瘤率。應(yīng)用H-E染色及TUNEL染色實(shí)驗(yàn)檢測腫瘤凋亡情況，計(jì)算壞死評分和凋亡指數(shù)。利用免疫熒光技術(shù)及Western Blot檢測皮下瘤內(nèi)生存、凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3及I

5、L-7R/Jak/Stat5信號通路相關(guān)蛋白IL-7R、Jak-1、Jak-3、Stat5、pJak-1、pJak-3、pStat5的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1.細(xì)胞形態(tài)學(xué)顯示：首次分離獲得的人BM-MSCs細(xì)胞體積大，胞漿與胞核的比例高，呈紡錘形、多角形或橢圓形，有長短不齊的突起。貼壁生長，相互間獨(dú)立，部分呈漩渦狀、輻射狀分布，形成成纖維樣細(xì)胞集落。隨著代數(shù)增加BM-MSCs得到純化。2-3代后BM-MSCs具有典型的

6、MSCs形態(tài)特征，呈較均一長梭形，核漿比例大，細(xì)胞間緊密貼附，呈魚群狀分布。
　　2.BM-MSC抑制K562細(xì)胞增殖：
　?、僭隗w外環(huán)境下，與BM-MSCs共培養(yǎng)后，K562細(xì)胞生長速度減慢。
　?、谠隗w內(nèi)環(huán)境下，相比 K562細(xì)胞組皮下瘤，K562+BM-MSCs組皮下瘤終體積、終重量減?。?.63±0.06 vs.1.97±0.04，P＜0.05）。
　　3.BM-MSCs抑制K562細(xì)胞凋亡：
　　

7、①在體外環(huán)境下，將K562細(xì)胞與BM-MSCs分別以100：1、10：1、5：1、1：1的比例共培養(yǎng)48h。流式結(jié)果顯示，加入BM-MSCs后K562細(xì)胞凋亡減少。并且隨著BM-MSCs濃度的增加，凋亡水平逐漸降低。
　?、谠隗w內(nèi)環(huán)境下，相比K562細(xì)胞組，K562細(xì)胞+BM-MSCs組皮下瘤凋亡、壞死程度減輕（凋亡指數(shù)8.98±0.06％vs.5.08±0.01％，壞死評分2.25±0.25 vs.1.5±0.33，P＜0.05

8、）。免疫熒光及Western blot結(jié)果也提示K562細(xì)胞+BM-MSCs組皮下瘤凋亡相關(guān)蛋白 Bcl-2蛋白表達(dá)量增加、Bax蛋白和Caspase-3蛋白表達(dá)量降低（P＜0.05）。
　　4.BM-MSCs阻滯K562細(xì)胞于G0/G1期：在體外環(huán)境下，將K562細(xì)胞與BM-MSCs分別以100：1、10：1、5：1、1：1的比例共培養(yǎng)48h。流式結(jié)果顯示，隨著BM-MSCs比例的升高，處于G0/G1期的K562細(xì)胞逐漸增多。<

9、br>　　5.BM-MSCs降低K562細(xì)胞對IM的敏感性：相比K562細(xì)胞+IM組，K562細(xì)胞+BM-MSCs+IM組皮下瘤終重量減輕（1.57±0.02g vs.1.17±0.06g，P＜0.05），抑瘤率降低（53.76±0.01％ vs.13.20±1.90％，P＜0.05），壞死程度增加（壞死評分0.25±0.25 vs.1.25±0.25，凋亡指數(shù)0.09±0.02％ vs.2.39±0.07％，P＜0.05）。免疫熒光及

10、Western blot結(jié)果提示，相比K562細(xì)胞+IM組，K562細(xì)胞+BM-MSCs+IM組皮下瘤內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低，Bax蛋白和Caspase-3蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）。
　　6.IL-7R/Jak/Stat5信號通路與BM-MSCs降低K562細(xì)胞對IM敏感性過程具有相關(guān)性：免疫熒光及Western blot結(jié)果顯示，相比K562細(xì)胞+IM組，K562細(xì)胞+BM-MSCs+IM組皮下瘤內(nèi)IL

11、-7R、Jak-1、Jak-3、Stat5、pJak-1、pJak-3、pStat5蛋白水平升高（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.CML患者來源BM-MSCs可以降低CML細(xì)胞凋亡、增殖水平，使細(xì)胞長期處于靜息狀態(tài)，增加其生存能力。
　　2.CML患者來源BM-MSCs降低CML細(xì)胞對IM的敏感性。
　　3.L-7R/Jak/Stat5信號通路有可能參與介導(dǎo)了BM-MSCs降低CML細(xì)胞對IM敏感性的過程。