內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和組蛋白甲基化在高同型半胱氨酸血癥促斑塊不穩(wěn)定中作用和機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　動(dòng)脈粥樣硬化是起源于脂代謝失衡和炎癥過(guò)度激活的慢性血管壁疾病。數(shù)十年來(lái)，動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)疾病已成為全球致殘、致死的首要原因。在我國(guó)，隨著人民生活水平提高和飲食習(xí)慣的改變，動(dòng)脈粥樣硬化及其相關(guān)疾病的發(fā)病率也呈現(xiàn)逐年升高的趨勢(shì)，成為主要的死亡原因。臨床研究表明引起急性心血管事件的主要原因是冠狀動(dòng)脈晚期粥樣硬化斑塊的突然破裂以及由此引發(fā)的血栓形成，而動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的不穩(wěn)定是導(dǎo)致斑塊破裂的重要原因。因此，研究影響斑塊易損性的

2、因素和機(jī)制，探索相應(yīng)的干預(yù)方法，對(duì)冠心病的防治具有重要的價(jià)值。數(shù)百項(xiàng)臨床觀察性研究提示同型半胱氨酸（Homocysteine，Hcy）與動(dòng)脈粥樣硬化密切相關(guān)。尤為重要的是，臨床中已證實(shí)高同型半胱氨酸血癥是頸動(dòng)脈和冠狀動(dòng)脈易損斑塊形成的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。在動(dòng)脈粥樣硬化ApoE-/-小鼠模型發(fā)現(xiàn)存在高同型半胱氨酸血癥促進(jìn)斑塊不穩(wěn)定。觀察發(fā)現(xiàn)病變區(qū)富含巨噬細(xì)胞凋亡和增大的壞死核心形成是斑塊進(jìn)展的重要組織學(xué)特征。巨噬細(xì)胞凋亡貫穿動(dòng)脈粥樣硬化形成始終

3、。與早期動(dòng)脈粥樣硬化形成不同，多個(gè)研究證實(shí)病變區(qū)巨噬細(xì)胞凋亡與不穩(wěn)定斑塊形成密切相關(guān)。但是高同型半胱氨酸血癥如何調(diào)控巨噬細(xì)胞凋亡和不穩(wěn)定斑塊形成機(jī)制不清。慢性持續(xù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活未折疊蛋白反應(yīng)促進(jìn)巨噬細(xì)胞凋亡。但高同型半胱氨酸血癥是否通過(guò)激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激促進(jìn)巨噬細(xì)胞凋亡和不穩(wěn)定斑塊形成，目前未見(jiàn)報(bào)道；另一方面，動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜，是環(huán)境和遺傳因素長(zhǎng)期共同作用的結(jié)果。最強(qiáng)的遺傳因素也僅能解釋大約10%的心血管發(fā)病機(jī)制。同型半胱氨酸

4、（Homocysteine，Hcy）是體內(nèi)轉(zhuǎn)甲基反應(yīng)的重要中間代謝產(chǎn)物，通過(guò)向DNA或蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)甲基調(diào)控基因表達(dá)。體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)已證實(shí)Hcy對(duì)基因組和候選基因甲基化的調(diào)控作用。所以，通過(guò)表觀調(diào)控探索Hcy促動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制至關(guān)重要。近期，越來(lái)越多的證據(jù)顯示組蛋白甲基化在斑塊不穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用。但是，組蛋白調(diào)控在Hcy促進(jìn)不穩(wěn)定斑塊中的作用目前仍不清楚。
　　所以，本研究中擬通過(guò)體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)，探討：
　?、倬奘杉?xì)胞凋亡

5、在Hcy促進(jìn)不穩(wěn)定斑塊形成中的作用。
　?、趦?nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在Hcy促進(jìn)巨噬細(xì)胞凋亡和不穩(wěn)定斑塊形成中的機(jī)制。
　?、劢M蛋白甲基化在Hcy促進(jìn)巨噬細(xì)胞凋亡和不穩(wěn)定斑塊形成中的作用。為臨床預(yù)防和干預(yù)動(dòng)脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊形成提供新的靶點(diǎn)。
　　方法：
　　第一部分：
　　8周齡雄性C57BL/6J小鼠和ApoE-/-小鼠各36只，隨機(jī)分為對(duì)照組（12只），高蛋氨酸飼養(yǎng)組（12只）和葉酸干預(yù)組（12只），對(duì)照組飼以普

6、通AIN-93G飼料，高蛋氨酸飼養(yǎng)組飼以含1.7%蛋氨酸的AIN-93G飼料，葉酸干預(yù)組飼以含1.7%的蛋氨酸加0.0008%葉酸AIN-93G飼料，連續(xù)飼喂養(yǎng)20周。干預(yù)期滿后，眼球取血，處死小鼠，全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血清Hcy和血脂水平。主動(dòng)脈大體染色和主動(dòng)脈竇染色評(píng)估斑塊面積和壞死核心面積，多種特殊染色評(píng)估斑塊穩(wěn)定性。TUNEL染色評(píng)估斑塊區(qū)凋亡細(xì)胞。培養(yǎng)Raw264.7巨噬細(xì)胞，在ox-LDL基礎(chǔ)上給予Hcy干預(yù)，AVPI和TUNE

7、L技術(shù)評(píng)估巨噬細(xì)胞凋亡，油紅O染色觀察巨噬細(xì)胞脂質(zhì)沉積，Western Blot檢測(cè)線粒體凋亡通路凋亡基因的表達(dá)；
　　第二部分：
　　8周齡雄性ApoE-/-小鼠36只，分為對(duì)照組（12只），高蛋氨酸飼養(yǎng)組（12只）和4-PBA干預(yù)組（12只），對(duì)照組飼以普通AIN-93G飼料，高蛋氨酸飼養(yǎng)組飼以含1.7%蛋氨酸的AIN-93G飼料，4-PBA干預(yù)組飼以含1.7%蛋氨酸的AIN-93G飼料12周后，腹腔注射4-PBA8周。

8、三組小鼠總共干預(yù)20周后，眼球取血，處死小鼠，全自動(dòng)生化儀檢測(cè)血清Hcy和血脂水平。主動(dòng)脈大體染色和主動(dòng)脈竇染色評(píng)估斑塊面積和壞死核心面積，多種特殊染色評(píng)估斑塊穩(wěn)定性。TUNEL染色評(píng)估斑塊凋亡細(xì)胞。培養(yǎng)Raw264.7巨噬細(xì)胞，在ox-LDL基礎(chǔ)上給予Hcy和4-PBA干預(yù)，AVPI和TUNEL技術(shù)評(píng)估巨噬細(xì)胞凋亡，油紅O染色觀察巨噬細(xì)胞脂質(zhì)沉積，Western Blot檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激因子和線粒體凋亡通路凋亡基因的表達(dá)；
　　第

9、三部分：
　　使用第一部分實(shí)驗(yàn)的ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈標(biāo)本，免疫組化和Western Blot檢測(cè)主動(dòng)脈H3K4m2和H3K9m2的表達(dá)。培養(yǎng)Raw264.7巨噬細(xì)胞，在ox-LDL基礎(chǔ)上給予Hcy、組蛋白抑制劑BIX01294和葉酸干預(yù)，AVPI和TUNEL檢測(cè)巨噬細(xì)胞凋亡，油紅O染色觀察巨噬細(xì)胞脂質(zhì)沉積，Western Blot檢測(cè)組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶G9a和SUV39H1的表達(dá)和線粒體凋亡途徑基因的表達(dá)。
　　結(jié)果我們觀

10、察到：
　　第一部分
　?。?）20周高蛋氨酸飲食成功誘導(dǎo)了Hhcy，但對(duì)血脂無(wú)明顯影響；
　?。?）單純高蛋氨酸飲食不能誘發(fā)C57BL/6J小鼠發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化斑塊；
　?。?）高蛋氨酸飲食誘導(dǎo)的Hhcy ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈斑塊面積和壞死核心面積增大；
　?。?）高蛋氨酸飲食誘導(dǎo)的Hhcy促進(jìn)ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定；
　?。?）高蛋氨酸飲食誘導(dǎo)的Hhcy促進(jìn)ApoE-/-小鼠

11、斑塊區(qū)細(xì)胞凋亡；
　?。?）Hcy促進(jìn)Raw264.7巨噬細(xì)胞脂質(zhì)沉積和泡沫化；
　?。?）Hcy促進(jìn)Raw264.7巨噬細(xì)胞發(fā)生凋亡；
　?。?）Hcy促進(jìn)Raw264.7巨噬細(xì)胞Cleaved caspase3，Bax表達(dá)，抑制Bcl-2表達(dá)；
　　第二部分：
　?。?）4-PBA改善Hhcy誘導(dǎo)的ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈斑塊進(jìn)展和壞死核心增大，抑制斑塊不穩(wěn)定；
　?。?0）4-PBA減緩高蛋氨酸

12、飲食誘導(dǎo)的 ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈斑塊細(xì)胞凋亡；
　?。?1）4-PBA抑制 Hcy誘導(dǎo)的Raw264.7巨噬細(xì)胞脂質(zhì)沉積和凋亡；
　?。?2）高蛋氨酸飲食誘導(dǎo)的Hhcy促進(jìn)小鼠主動(dòng)脈組織ERS因子表達(dá)升高。4-PBA具有拮抗作用；
　?。?3）Hcy促進(jìn)Raw264.7巨噬細(xì)胞ERS因子表達(dá)升高。4-PBA具有拮抗作用；
　?。?4）4-PBA能夠改善Hcy誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞Bcl-2途徑凋亡因子變化；
　

13、?。?5）高蛋氨酸飲食誘導(dǎo)的Hhcy抑制ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈斑塊H3K9m2表達(dá)，但對(duì)H3K4m2表達(dá)無(wú)明顯影響；
　　（16）Hcy調(diào)控Raw264.7巨噬細(xì)胞組蛋白H3K9m2和組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶G9a表達(dá)；
　?。?7）組蛋白H3K9m2參與調(diào)控Hcy誘導(dǎo)的體外巨噬細(xì)胞泡沫化；
　?。?8）組蛋白H3K9m2調(diào)控Hcy誘導(dǎo)的Raw264.7巨噬細(xì)胞凋亡；
　?。?9）組蛋白H3K9m2調(diào)控線粒體凋亡通路基