鹿角方中鹿角蛋白的制備及其對兔膝軟骨細(xì)胞的保護(hù)作用.pdf

1、目的：骨關(guān)節(jié)炎是一類老年人高發(fā)的退行性病變，《嚴(yán)氏濟(jì)生方》中《鹿角丸》是治療骨關(guān)節(jié)炎的經(jīng)典方劑，但是其傳統(tǒng)劑型服用量大，給患者帶來不便。鹿角方組成參考《鹿角丸》的處方組成，對鹿角方中的鹿角蛋白進(jìn)行提取工藝優(yōu)化及酶解工藝優(yōu)化以提高鹿角蛋白口服生物利用度；通過離體外翻腸囊實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞藥效的實(shí)驗(yàn)，為鹿角蛋白及鹿角方復(fù)方產(chǎn)品口服劑型開發(fā)提供藥動學(xué)實(shí)驗(yàn)依據(jù)及為其在OA治療方面提供藥效研究基礎(chǔ)。
　　方法：水為提取溶劑采用冷凝回流提取鹿角中總蛋

2、白，以蛋白質(zhì)含量為考察指標(biāo)，采取L9（34）正交試驗(yàn)，對提取時間、提取次數(shù)、液料比進(jìn)行考察，優(yōu)選出鹿角蛋白的提取工藝。使用市面上常見的胃蛋白酶、酸性蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶七種蛋白酶對鹿角蛋白進(jìn)行水解作用，通過酶解物水解度及體外抗氧化活性的測定，選取合適鹿角蛋白酶解的蛋白酶。優(yōu)選出風(fēng)味蛋白酶及堿性蛋白酶進(jìn)行鹿角蛋白雙酶解工藝優(yōu)化，以水解度及蛋白酶解物O2-·抑制率為雙目標(biāo)，通過Box-Behnke

3、n試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行鹿角蛋白酶解響應(yīng)曲面優(yōu)化。建立大鼠外翻腸囊吸收模型，考察鹿角蛋白酶解前后對總氨基酸、羥脯氨酸、甘氨酸的吸收影響。通過兔膝軟骨體外培養(yǎng)，建立IL-1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞炎癥模型及H2O2誘導(dǎo)氧化損傷模型，評價藥物對軟骨細(xì)胞的保護(hù)作用。
　　結(jié)果：⑴通過正交試驗(yàn)優(yōu)化后，選擇鹿角蛋白終提取工藝為：提取時間為2h，提取次數(shù)為4次，料液比1:10。⑵單酶解實(shí)驗(yàn)中，風(fēng)味蛋白酶酶解物水解度最高，酶解330min后水解度為33.21±9.

4、29％；風(fēng)味蛋白酶解物·OH清除能力清除能力較強(qiáng)，酶解產(chǎn)物IC50為1.04 mg/mL；堿性蛋白酶酶解物O2-·清除效果最強(qiáng)，酶解產(chǎn)物IC50為1.87mg/mL。⑶通過對鹿角雙酶解實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行擬合，得到最優(yōu)雙酶解工藝參數(shù)為酶解pH7.5，酶解溫度51.6℃，風(fēng)味蛋白酶：堿性蛋白酶比例為7:3。⑷腸吸收實(shí)驗(yàn)中，酶解后的鹿角蛋白的腸吸收液中，Hyp、Gly及總氨基酸的Q120及Ka較同濃度未酶解的鹿角蛋白皆有顯著提高（P＜0.01）。⑸

5、濃度為10μg/mL的酶解鹿角蛋白及鹿角方藥物都能顯著增加IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞的增殖（P＜0.05）。酶解鹿角蛋白及鹿角方對H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞氧化損都有很好的保護(hù)作用，能顯著提高細(xì)胞存活率（P＜0.01）。酶解鹿角蛋白及鹿角方藥物在100μg/mL的劑量干預(yù)下都能顯著提高（P＜0.05）IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞內(nèi)COLⅡ的含量及細(xì)胞培養(yǎng)上清中GAG的含量。
　　結(jié)論：①通過離體外翻腸囊實(shí)驗(yàn)研究，鹿角蛋白經(jīng)酶解工藝后，可以大幅提