Poh1對(duì)tau蛋白聚集體清除的影響.pdf

1、在真核細(xì)胞中，錯(cuò)誤折疊或異常聚集的蛋白通常有三種命運(yùn)，在分子伴侶的作用下去折疊以恢復(fù)正常結(jié)構(gòu)，通過泛素-蛋白酶體系統(tǒng)被降解或者自噬-溶酶體系統(tǒng)被清除。通常情況下，泛素-蛋白酶體系統(tǒng)是降解錯(cuò)誤折疊蛋白的主要途徑，當(dāng)其活性損傷或功能障礙時(shí)，自噬-溶酶體通路會(huì)代償性地被激活。Poh1是裂殖酵母中Pad1在人體中的同源物，參與維持細(xì)胞活性，調(diào)節(jié)胚胎干細(xì)胞分化，促進(jìn)腫瘤的形成等過程。此外，Poh1是26S蛋白酶體的一個(gè)亞基，具有去泛素化酶活性。T

2、au蛋白相關(guān)疾病是由于tau蛋白異常聚集而導(dǎo)致的一類神經(jīng)退行性疾病，其典型病理學(xué)特征是出現(xiàn)胞內(nèi)的細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)損壞，以及在神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中出現(xiàn)含tau蛋白的聚集體。此外，這類疾病患者體內(nèi)普遍存在泛素-蛋白酶體系統(tǒng)功能缺陷。而在蛋白酶體功能障礙時(shí)，自噬-溶酶體通路的活性將代償性增強(qiáng)以清除胞內(nèi)異常聚集的蛋白質(zhì)。Poh1與異常聚集的蛋白質(zhì)經(jīng)自噬途徑的降解有關(guān)。蛋白酶體活性被抑制時(shí)，Poh1缺陷可以導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集體的清除障礙，而注入外源性K

3、63連接的泛素鏈可促進(jìn)蛋白質(zhì)聚集體的清除。據(jù)此，我們推測(cè)Poh1可能通過K63連接的泛素鏈的介導(dǎo)參與異常聚集的tau蛋白的清除過程。
　　本研究以HEK293/tau441細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料，采用轉(zhuǎn)染Poh1 siRNA的方法下調(diào)內(nèi)源性Poh1的表達(dá)水平，然后用5μM蛋白酶體抑制劑MG132處理細(xì)胞24 hr，以誘導(dǎo)胞內(nèi)含tau蛋白的聚集體的形成;之后將MG132洗脫，觀察異常聚集的tau蛋白的降解過程并對(duì)其機(jī)制進(jìn)行探討。結(jié)果顯示:(

4、1)與對(duì)照組相比，Poh1 siRNA的濃度為80 nM時(shí)，內(nèi)源性Poh1表達(dá)水平下降多達(dá)60％，抑制效果顯著(p＜0.001)。(2) MG132處理細(xì)胞后，tau蛋白向核周聚集，vimentin顯色陽性并在核周出現(xiàn)蛋白質(zhì)聚集體形成的典型的球狀聚集物。同時(shí)，tau蛋白和vimentin具有共定位關(guān)系。MG132洗脫后，tau蛋白散在分布在胞漿中，同時(shí)，蛋白質(zhì)聚集體出現(xiàn)解聚。(3)MG132處理細(xì)胞后，tau和Poh1在近核區(qū)共定位并形

5、成了明顯的球狀聚集體;MG132洗脫處理組中，tau和Poh1的聚集程度明顯降低，但是二者還保持共定位關(guān)系。(4)與正常對(duì)照組比較，單純MG132處理會(huì)導(dǎo)致tau含量增加(p＜0.01)，MG132洗脫后，tau含量顯著減少(p＜0.001);Poh1 siRNA處理細(xì)胞后，與正常對(duì)照組比較，MG132處理后tau含量顯著增加(p＜0.001)，去除MG132后，tau含量顯著減少(p＜0.001)。但是與無Poh1 siRNA處理組相

6、比，Poh1 siRNA組的MG132 wash/MG132的比值較大(p＜0.01)。(5)與正常對(duì)照組相比，單純MG132處理會(huì)使LC3-Ⅱ表達(dá)水平上調(diào)(p＜0.01)，洗脫MG132后LC3-Ⅱ表達(dá)水平下降;Poh1 siRNA處理組細(xì)胞中，MG132處理組或MG132洗脫組中LC3-Ⅱ的表達(dá)水平均無明顯改變。(6)與正常對(duì)照組比較，MG132單獨(dú)處理組中，K63連接的泛素鏈含量明顯增加(p＜0.001);洗脫MG132后，K63

7、連接的泛素鏈的含量顯著下降(p＜0.001)。在下調(diào)Poh1表達(dá)水平的基礎(chǔ)上，MG132處理后，相對(duì)于正常對(duì)照組，K63連接的泛素鏈含量明顯增加(p＜0.01)，MG132洗脫后，K63連接的泛素鏈含量減少(p＜0.01)。但是和MG132單獨(dú)處理組相比，下調(diào)Poh1表達(dá)水平后用MG132處理，K63連接的泛素鏈含量明顯減少(p＜0.01)。(7)與正常對(duì)照組相比，單純MG132處理組與Poh1 siRNA和MG132同時(shí)處理組細(xì)胞中，

8、ac-tubulin表達(dá)水平都顯著下降(p＜0.001);與MG132單獨(dú)處理組比較，抑制Poh1表達(dá)水平后的MG132處理組中，ac-tubulin含量無明顯改變。與Poh1 siRNA非處理組的MG132洗脫組比較，抑制Poh1表達(dá)后再洗脫MG132，ac-tubulin含量增加(p＜0.01)。但是，抑制Poh1表達(dá)水平對(duì)細(xì)胞中HDAC6的含量無影響。綜合上述結(jié)果可知，Poh1在tau蛋白的清除過程中發(fā)揮重要作用。Poh1通過調(diào)節(jié)