非血緣臍血移植后發(fā)生植入前綜合征效應(yīng)細(xì)胞的探索.pdf

1、目的：
　　植入前綜合征（PES）是一種高發(fā)于非血緣臍血移植（UCBT）后在中性粒細(xì)胞植入之前，以發(fā)熱、皮疹、腹瀉等為主要臨床表現(xiàn)的一種免疫反應(yīng)。發(fā)生重癥PES的患者，移植相關(guān)死亡率明顯增高。本研究通過(guò)對(duì)UCBT后發(fā)生PES患者外周血進(jìn)行供受者基因嵌合狀態(tài)檢測(cè)，了解發(fā)生PES時(shí)細(xì)胞的來(lái)源；根據(jù)血清細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)可溶性ST2（sST2）在PES發(fā)生時(shí)明顯升高，選擇新鮮臍血和外周血干細(xì)胞，采用IL-33和sST2進(jìn)行體外刺激，探

2、索發(fā)生PES的效應(yīng)細(xì)胞，為PES發(fā)病機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　本研究分為兩部分。
　　第一部分：UCBT后發(fā)生PES的細(xì)胞來(lái)源的研究。根據(jù)本中心先前的研究發(fā)現(xiàn)UCBT后PES發(fā)生的中位時(shí)間為UCBT后第7天（+7d），選擇移植患者+7d的外周血標(biāo)本，采用短串聯(lián)重復(fù)序列聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（STR-PCR）技術(shù)檢測(cè)發(fā)生PES組和未發(fā)生PES組患者供受者嵌合狀態(tài)，分析發(fā)生PES的細(xì)胞來(lái)源。
　　第二部分：UCB

3、T后發(fā)生PES的效應(yīng)細(xì)胞的探討。一、UCBT后PES發(fā)生時(shí)各種免疫細(xì)胞及其亞群和相關(guān)細(xì)胞因子的檢測(cè)。檢測(cè)PES發(fā)生時(shí)的T、B、NK和單核細(xì)胞及其亞群的變化；檢測(cè)患者移植前、移植當(dāng)天、PES發(fā)生時(shí)不同時(shí)間點(diǎn)的外周血的白細(xì)胞數(shù)，血漿C-反應(yīng)蛋白和血清中相關(guān)細(xì)胞因子的變化。二、不同來(lái)源的移植物體外刺激實(shí)驗(yàn)：sST2在PES發(fā)生時(shí)顯著增高，而ST2是IL-33的孤兒受體，擬從IL-33/ST2信號(hào)通路來(lái)推證PES的效應(yīng)細(xì)胞。應(yīng)用 IL-33,s

4、ST2刺激新鮮臍血、外周血干細(xì)胞（動(dòng)員采集的同胞供者），每種類型的細(xì)胞分4組：實(shí)驗(yàn)組：A．IL-33+sST2組；對(duì)照組：B．sST2組；C．IL-33組；D．空白組。經(jīng)體外培養(yǎng)0、12、24和72小時(shí)后，細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)算刺激前后細(xì)胞總數(shù)，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)刺激前后細(xì)胞亞群及ST2受體表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　第一部分 UCBT后發(fā)生PES的細(xì)胞來(lái)源的研究
　　STR-PCR檢測(cè)臍血及受者移植前后的標(biāo)本比對(duì)供受者的嵌合狀態(tài)

5、，結(jié)果顯示：UCBT+7d供者的嵌合度發(fā)生PES組明顯高于未發(fā)生PES組，分別為70.58±22.86%與37.18±18.96%，兩組之間有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.0001。
　　第二部分 UCBT后發(fā)生PES的效應(yīng)細(xì)胞的探討
　　一、UCBT后發(fā)生PES時(shí)各種免疫細(xì)胞及其亞群和相關(guān)細(xì)胞因子的檢測(cè)
　　1.白細(xì)胞的變化PES組與無(wú)PES組在移植前、移植當(dāng)天、PES發(fā)生時(shí)的白細(xì)胞計(jì)數(shù)組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＞0.05。<

6、br>　　2.PES發(fā)生時(shí)T、B、NK和單核細(xì)胞的細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果：CD45+CD3+T淋巴細(xì)胞、CD45+CD3-CD19+B淋巴細(xì)胞、CD45+CD3-CD56+NK細(xì)胞、CD45+CD3-CD14+單核細(xì)胞分別占90%，0.3%，2.1%和0.2%。PES組與無(wú)PES組的T、B、NK和單核細(xì)胞的各細(xì)胞亞群比例無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＞0.05。
　　3.C-反應(yīng)蛋白的變化在移植前、移植當(dāng)天、PES發(fā)生時(shí)，PES組和無(wú)PES組兩組

7、之間無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＞0.05。
　　4.血清細(xì)胞因子的變化
　　發(fā)生PES時(shí)細(xì)胞因子IL-6、MCP-1和sST2在PES組明顯高于無(wú)PES組（P<0.05）；PES組自身比較患者發(fā)生PES時(shí)也顯著高于移植前、移植當(dāng)天的水平（P<0.05）。PES患者治療有效者細(xì)胞因子IL-6和MCP-1明顯下降并恢復(fù)至發(fā)生前水平（P<0.01），而sST2與PES發(fā)生時(shí)相比雖有所下降但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。
　　發(fā)生P

8、ES時(shí)IFN-γ、IL-2、IL-1Rα、IL-4、IL-8、IL-17A、IL-33、MIP-1α、MIP-1β和TNF-α表達(dá)水平兩組相近無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），同時(shí)PES組患者在不同的時(shí)間點(diǎn)，自身對(duì)比其表達(dá)水平相近無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。
　　二、不同來(lái)源的移植物體外刺激實(shí)驗(yàn)
　　1.細(xì)胞數(shù)量的變化：新鮮臍血和外周血干細(xì)胞經(jīng)IL-33、sST2刺激培養(yǎng)后，各組刺激前后細(xì)胞數(shù)量無(wú)明顯增加（P>0.05），兩種

9、來(lái)源不同的細(xì)胞刺激培養(yǎng)12h后均出現(xiàn)多形性變化，此后隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)形態(tài)變化不顯著。
　　2.T、B、NK和單核細(xì)胞各亞群的變化：新鮮臍血經(jīng)Ficoll提取單個(gè)核細(xì)胞后，臍血提取的單個(gè)核細(xì)胞比例分別為T(mén)淋巴細(xì)胞30-50%、B淋巴細(xì)胞1-3%，NK細(xì)胞5-8%，單核細(xì)胞5-13%。外周血干細(xì)胞中T淋巴細(xì)胞20-35%、B淋巴細(xì)胞2-5%，NK細(xì)胞3-9%，單核細(xì)胞18-32%。經(jīng)刺激培養(yǎng)12、24和72h后，四組的T、B、NK和單核

10、細(xì)胞亞群比例無(wú)明顯差異（P>0.05），隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，有少量細(xì)胞凋亡，實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞亞群比例也無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。
　　3.T、B、NK和單核細(xì)胞ST2受體表達(dá)情況：新鮮臍血和外周血干細(xì)胞中ST2受體表達(dá)相似，單核細(xì)胞上ST2受體表達(dá)量高達(dá)53-90%，其次是B淋巴細(xì)胞亞群約為30-60%，T淋巴細(xì)胞及NK細(xì)胞亞群表達(dá)量低，分別為2-5%和3-10%。而四組的各細(xì)胞亞群ST2受體表達(dá)無(wú)明顯變化

11、（P>0.05），實(shí)驗(yàn)各組細(xì)胞不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)的各細(xì)胞亞群ST2表達(dá)也無(wú)顯著變化（P>0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.UCBT后PES是供者開(kāi)始植入時(shí)引發(fā)多種細(xì)胞因子參與的免疫反應(yīng)，其效應(yīng)細(xì)胞推測(cè)來(lái)源于供者，供者的早期嵌合是PES發(fā)生的高危因素。
　　2.血清中單核細(xì)胞相關(guān)的趨化因子（MCP-1）在PES發(fā)生時(shí)明顯升高，而淋巴細(xì)胞相關(guān)的較特異的細(xì)胞因子（IL-2、IL-4、IL-8、IL-17A）在PES發(fā)生時(shí)無(wú)顯著變

12、化，PES的臨床表現(xiàn)主要在皮膚、腸道等組織中，推斷組織中的單核巨噬細(xì)胞可能是PES的主要效應(yīng)細(xì)胞。
　　3.加入IL-33和sST2進(jìn)行單純的體外培養(yǎng)，未見(jiàn)到免疫細(xì)胞的增殖和ST2受體表達(dá)的增高，但不能確定細(xì)胞因子水平是否發(fā)生變化，需進(jìn)一步檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中細(xì)胞因子的變化，觀察IL-33/ST2信號(hào)通路及sST2是否對(duì)下游細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)存在影響，從而引起細(xì)胞因子的分泌。同時(shí)本實(shí)驗(yàn)也需要加測(cè)各免疫細(xì)胞活化的指標(biāo)，如HLA-DR,CD27