熱應(yīng)激下擬南芥原生質(zhì)體生長、發(fā)育的初步研究.pdf

1、正確理解植物體對環(huán)境刺激的感受、響應(yīng)及適應(yīng)機(jī)理是人類合理栽培農(nóng)作物、高效生產(chǎn)糧食等生活資源的重要基礎(chǔ)。高溫作為植物面臨的主要逆境之一，研究植物感受高溫刺激的生理響應(yīng)及信號途徑十分必要。大量研究證明，高溫能夠引起植物細(xì)胞鈣信號波動以及細(xì)胞骨架解聚行為，但這種鈣信號和細(xì)胞骨架的變化，究竟會對植物細(xì)胞的生長、發(fā)育帶來怎樣的影響？是幫助細(xì)胞抵御高溫脅迫還是誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入程序性死亡？本課題綜合運(yùn)用了植物生理學(xué)、藥理學(xué)及植物組織培養(yǎng)工程的方法和手段，

2、從單細(xì)胞水平研究熱應(yīng)激下擬南芥原生質(zhì)體生長、發(fā)育的變化，完善了植物原生質(zhì)體耐熱性的評價(jià)方法。同時(shí)考察了鈣信號和細(xì)胞骨架在熱刺激導(dǎo)致的細(xì)胞變化中的作用，并探索擬南芥原生質(zhì)體感受、傳遞熱信號的機(jī)理。本課題主要取得了以下幾方面的結(jié)果：
　　 ① 擬南芥原生質(zhì)體分離培養(yǎng)的最佳條件：選取生長27天左右的擬南芥上部幼嫩葉片，4°C低溫預(yù)處理24h，28°C靜置酶解14h，600r/min離心三次，每次10min，用Rinse稀釋定容后以1％

3、低凝固點(diǎn)瓊脂糖配制的B5培養(yǎng)基作為包埋材料，細(xì)胞包埋密度為2×105個(gè)/mL，生長素為1.0mg/mL2,4-D，細(xì)胞分裂素為0.5mg/mLBA。在此條件下分離所得的原生質(zhì)體產(chǎn)量平均值為2.91×106個(gè)·g-1，活力平均值為84.87％（圖2.1-2.3）。包埋培養(yǎng)7天后，擬南芥原生質(zhì)體存活率平均值為51.48％，分裂率平均值為11.48％（圖2.5,2.6）。
　　 ② 施加外源鈣預(yù)處理對擬南芥原生質(zhì)體的生長、發(fā)育起著積極

4、的作用，而施加鈣抑制劑La3+，RR，異博定，和EGTA均能不同程度的抑制擬南芥原生質(zhì)體的生長發(fā)育。具體表現(xiàn)在52°C熱激10min后，外源鈣預(yù)處理組細(xì)胞活性平均值為65.67％，而鈣抑制劑組細(xì)胞活性均在15.00％以下（圖3.1，3.2）；37°C熱激10min后，經(jīng)過7天的包埋培養(yǎng)后觀察，外源鈣預(yù)處理組細(xì)胞存活率為68.92％，細(xì)胞壁再生率79.69％，分裂率為18.23％（圖3.4-3.7），而鈣抑制劑組細(xì)胞存活率均低于10.00

5、％，細(xì)胞壁再生率低于30％，細(xì)胞不分裂。
　　 ③ 同時(shí)施加微管骨架解聚劑（Oryzalin，Oy）和微絲骨架解聚劑（Cytochalasin D，CD）或單獨(dú)施加Oy均能夠促進(jìn)熱激后擬南芥游離態(tài)原生質(zhì)體細(xì)胞的生長、發(fā)育。具體表現(xiàn)在52°C熱激10min后，微管微絲共同解聚和微管解聚細(xì)胞能夠?qū)⒃|(zhì)體活性提高5倍左右（圖4.1,4.2）；37°C熱激10min后，經(jīng)過7天的包埋培養(yǎng)后觀察，能夠微管微絲同時(shí)解聚能夠?qū)⒃|(zhì)體存活率

6、、細(xì)胞壁再生率以及細(xì)胞分裂率提高50％（圖4.3-4.5）。而微絲骨架預(yù)解聚，對高溫脅迫后擬南芥原生質(zhì)體細(xì)胞的形態(tài)，生理活性及細(xì)胞的生長發(fā)育無明顯影響。
　　 ④ 對細(xì)胞同時(shí)施加鈣通道抑制劑La3+和細(xì)胞骨架解聚預(yù)處理，能夠降低細(xì)胞骨架解聚對擬南芥原生質(zhì)體生長、發(fā)育的積極作用。具體表現(xiàn)在破壞細(xì)胞形態(tài)，生理活性，以及細(xì)胞生長發(fā)育過程中細(xì)胞生理活性，細(xì)胞壁再生，細(xì)胞分裂的積極作用。52°C熱激下，La+Oy+CD組游離態(tài)細(xì)胞活性平均

7、值僅為16.67％，而Oy+CD組細(xì)胞活力為68.27％（圖4.6）；包埋培養(yǎng)7天后，La+Oy+CD組細(xì)胞存活率平均值為18.32％，細(xì)胞壁再生率為36.78％，細(xì)胞不發(fā)生分裂，而Oy+CD組細(xì)胞存活率平均值為72.92％，細(xì)胞壁再生率為78.97％，細(xì)胞分裂率為19.68％（圖4.7,4.8）。
　　 綜上所述，鈣信號波動和細(xì)胞骨架解聚對熱應(yīng)激下細(xì)胞生長、發(fā)育有著積極的影響，并且兩者之間存在某種內(nèi)部聯(lián)系，它們可能相互作用，共