人參皂苷Rd通過組蛋白乙?；{(diào)控BDNF對低灌注腦損傷小鼠保護(hù)作用的研究.pdf

1、背景：充足的腦血流量對于維持大腦功能正常運(yùn)轉(zhuǎn)至關(guān)重要，慢性腦低灌注（Chronic cerebral hypoperfusion,CCH）表現(xiàn)為腦血流量持續(xù)減少，作為多種腦血管疾病發(fā)展的共同病理過程，可導(dǎo)致認(rèn)知功能減退。然而，CCH致認(rèn)知功能障礙發(fā)病機(jī)理不完全清楚，尚無特效藥物和治療手段，因此，積極尋找預(yù)防、治療策略是臨床亟待解決的重要課題。
　　研究發(fā)現(xiàn)，CCH致認(rèn)知功能障礙的機(jī)制復(fù)雜，主要的病理過程包括缺血導(dǎo)致細(xì)胞能量缺失、腦

2、白質(zhì)損傷、神經(jīng)發(fā)生受損、血腦屏障破壞、脂質(zhì)代謝和神經(jīng)血管單元功能紊亂、細(xì)胞壞死和凋亡等。神經(jīng)元作為CNS中最小的功能單元，一定數(shù)量及功能正常的神經(jīng)元是學(xué)習(xí)記憶的基礎(chǔ)。CCH中，神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生凋亡、壞死等一系列的病理生理學(xué)變化，進(jìn)而導(dǎo)致大腦高級神經(jīng)功能損傷，如運(yùn)動功能損傷、認(rèn)知能力下降等。CCH致神經(jīng)元損傷，前額葉皮層（Prefrontal cortex,PFC）和海馬（Hippocampus,Hipp）是最受關(guān)注的腦區(qū)，被認(rèn)為是CCH后認(rèn)

3、知功能受損害的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。PFC和Hipp是參與空間學(xué)習(xí)記憶的中樞腦區(qū)，PFC和Hipp對缺血缺氧十分敏感，長期缺血導(dǎo)致該部位神經(jīng)元功能和結(jié)構(gòu)的損害；其結(jié)構(gòu)異常與學(xué)習(xí)記憶能力等行為學(xué)改變關(guān)系密切，進(jìn)而引起學(xué)習(xí)記憶能力的下降，甚至癡呆。因此，研發(fā)可促進(jìn)腦缺血后PFC和Hipp區(qū)神經(jīng)元存活的措施，如神經(jīng)保護(hù)劑，對認(rèn)知功能障礙的治療具有重要意義。
　　祖國醫(yī)學(xué)一直致力于研究、開發(fā)用于CCH預(yù)防、治療的藥物，其中人參（Radix Gins

4、eng）為常用的經(jīng)典藥物之一。人參隸屬于五加科（Araliaceae），常用作功能性保健食品的替代或補(bǔ)充用藥，亦用于抗癌、抗糖尿病和抗炎治療；同時，人參具有良好的神經(jīng)保護(hù)作用。人參皂苷Rd（Ginsenoside Rd,GSRd）是人參中的主要活性成分之一，大量研究證實(shí)，GSRd保護(hù)腦缺血及神經(jīng)退行性病變模型中的神經(jīng)元、改善動物的空間學(xué)習(xí)能力并預(yù)防記憶喪失，但其基本的機(jī)制仍然未知。近期研究證實(shí)，人參皂苷的神經(jīng)保護(hù)作用與腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子

5、（Brain-Derived Neurotrophic Factor,BDNF）的生成關(guān)系密切。BDNF是一種重要的神經(jīng)營養(yǎng)蛋白，在神經(jīng)可塑性、神經(jīng)元再生和細(xì)胞存活中起關(guān)鍵作用，常于缺氧或缺血后釋放以保護(hù)腦免受損傷。臨床常用藥物能夠發(fā)揮增強(qiáng)記憶、神經(jīng)保護(hù)作用等，部分得益于促進(jìn)或提高BDNF的表達(dá)。然而，人參皂苷是如何調(diào)控BDNF、它是否可通過 BDNF發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用目前尚不清楚。
　　多種機(jī)制參與調(diào)控BDNF的表達(dá)，其中表觀遺傳

6、學(xué)修飾機(jī)制因是多種分子的共同上游調(diào)控機(jī)制而備受關(guān)注。表觀遺傳學(xué)修飾機(jī)制包含組蛋白的乙酰化修飾、DNA的甲基化修飾、非編碼RNA調(diào)控和染色質(zhì)重塑等，影響基因表達(dá)、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期等。其中，組蛋白乙酰化調(diào)控被證實(shí)參與動物學(xué)習(xí)記憶活動的形成和維持。組蛋白乙?；癁橐环N高度動態(tài)的調(diào)節(jié)過程，主要在兩類酶，即組蛋白去乙?；福℉istone deacetylase,HDAC）和組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（Histone acetyltransferase,HAT）

7、的作用下實(shí)現(xiàn)。一般情況下，HDAC抑制基因的表達(dá)，而HAT促進(jìn)基因的表達(dá)。因此，本課題擬在小鼠CCH模型中，探討GSRd是否可通過改變組蛋白乙?；揎?，調(diào)控BDNF表達(dá)，從而發(fā)揮對PFC和Hipp區(qū)神經(jīng)元的保護(hù)作用。
　　目的：以CCH小鼠為研究對象，探討GSRd通過增加BDNF的生成，提高神經(jīng)元存活，用于治療CCH致認(rèn)知功能障礙的分子機(jī)制。進(jìn)一步，通過體外細(xì)胞培養(yǎng)體系模擬CCH病理狀態(tài)，闡明組蛋白乙?；揎椪{(diào)控GSRd介導(dǎo)的BD

8、NF生成過程、參與GSRd促神經(jīng)元存活，從而改善CCH引起的學(xué)習(xí)記憶障礙的分子機(jī)制，為臨床治療CCH造成的認(rèn)識功能障礙提供新思路和可能的治療手段。
　　方法：
　　1.微彈簧圈法造成雙側(cè)頸動脈狹窄（Bilateral Carotid Artery stenosis,BCAS）建立CCH小鼠模型；Morris水迷宮行為學(xué)評價CCH是否導(dǎo)致小鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙，進(jìn)而給予GSRd治療21d，是否可改善CCH導(dǎo)致的小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙。

9、
　　2.蘇木精-伊紅（Hematoxylin-Eosin,HE）染色觀察，給予或不給予GSRd治療CCH小鼠的PFC、CA1區(qū)域神經(jīng)元形態(tài)、存活率變化；采用Western blot方法，檢測CCH模型小鼠腦內(nèi)凋亡信號Caspase-3蛋白表達(dá)的變化，并觀察給予GSRd治療后是否逆轉(zhuǎn)這些蛋白的表達(dá)。
　　3.實(shí)時定量PCR（Quantitative Real-time PCR,qPCR）、酶聯(lián)免疫吸附測定法（Enzyme L

10、inked Immunosorbent Assay,ELISA）檢測各組小鼠海馬中BDNF的表達(dá)變化，探討GSRd神經(jīng)保護(hù)作用可能的機(jī)制。
　　4.體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元，建立氧糖剝奪模型（Oxygen-glucose deprivation,OGD）模擬CCH模型，采用噻唑藍(lán)（Methylthiazolyldiphenyl-Tetrazolium bromide,MTT）、乳酸脫氫酶（Lactate Dehydrogenase,LD

11、H）檢測細(xì)胞活力、流式細(xì)胞技術(shù)（Flow Cytometry,FCM）檢測神經(jīng)元的凋亡現(xiàn)象，以及給予不同濃度梯度GSRd時神經(jīng)元存活率的變化；采用Western blot方法，檢測細(xì)胞內(nèi)凋亡信號Caspase-3蛋白表達(dá)的變化，評估體外GSRd的神經(jīng)保護(hù)能力。
　　5.采用培養(yǎng)神經(jīng)元OGD模型，qPCR、ELISA法，觀察不同濃度梯度GSRd對BDNF表達(dá)量的影響。
　　6.采用Western blot方法，檢測給予或不給予

12、GSRd治療后，CCH小鼠腦中p300/CBP結(jié)合蛋白（CREB binding proteins,CBP）、組蛋白H3乙?；ˋcetylated Histone H3,Ac-H3）、組蛋白去乙?；?（histone deacetylase2,HDAC2）表達(dá)水平的變化，旨在探究BDNF表達(dá)調(diào)控的上游表觀遺傳修飾機(jī)制。
　　7.體外采用培養(yǎng)神經(jīng)元OGD模型，進(jìn)一步確認(rèn)GSRd對Ac-H3、HDAC2表達(dá)水平變化的影響，分析對B

13、DNF表達(dá)的上游調(diào)控機(jī)制。
　　8.采用染色質(zhì)免疫共沉淀（Chromatin immunoprecipitation,ChIP）方法，觀察GSRd介導(dǎo)的BDNF表達(dá)增加是否通過促進(jìn)Ac-H3與BDNF啟動子IV區(qū)域的結(jié)合，或降低HDAC與BDNF啟動子IV區(qū)域的結(jié)合實(shí)現(xiàn)；進(jìn)一步，預(yù)先給予HDAC的抑制劑MS-275，觀察是否可增強(qiáng)該效應(yīng)，進(jìn)而最終影響B(tài)DNF的表達(dá)。
　　結(jié)果：
　　1.Morris水迷宮結(jié)果顯示，與假

14、手術(shù)組相比，CCH導(dǎo)致小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙，表現(xiàn)為小鼠搜索平臺時間（潛伏期）延長，目標(biāo)象限游泳距離百分比降低，穿越平臺次數(shù)減少（P?0.01）；與模型組相比，GSRd治療后，顯著改善CCH導(dǎo)致的小鼠空間學(xué)習(xí)記憶障礙（P＜0.05或P＜0.01）。
　　2.HE染色結(jié)果證實(shí)，與假手術(shù)組相比，CCH模型小鼠的PFC、CA1區(qū)域神經(jīng)元的結(jié)構(gòu)不清晰，出現(xiàn)細(xì)胞核固縮和大量細(xì)胞凋亡（P＜0.01）；與CCH模型組相比，給予GSRd治療后神經(jīng)元的形

15、態(tài)結(jié)構(gòu)與正常相似，細(xì)胞凋亡的比例下降（P＜0.01）；Western blot方法CCH小鼠腦內(nèi)凋亡信號Caspase-3蛋白表達(dá)增加，給予GSRd治療后降低Cleaved Caspase-3的表達(dá)（P＜0.05或P＜0.01）。
　　3.qPCR、ELISA法檢測發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，CCH小鼠海馬中BDNF的mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著下降（P＜0.01）；與模型組相比，GSRd治療后BDNF的表達(dá)可恢復(fù)至近正常水平。
　

16、　4.MTT、LDH、FCM結(jié)果顯示，培養(yǎng)的神經(jīng)元經(jīng)OGD損傷后，神經(jīng)元出現(xiàn)凋亡，存活率顯著下降（P＜0.01），不同濃度GSRd處理則能提高細(xì)胞存活（P＜0.05或P＜0.01）；同時，GSRd處理能夠降低OGD條件下凋亡信號Caspase-3蛋白的高表達(dá)（P＜0.05或P＜0.01），提示GSRd的體外亦具有神經(jīng)保護(hù)作用。
　　5.與體內(nèi)結(jié)果一致，采用體外培養(yǎng)神經(jīng)元OGD模型，亦觀察并確認(rèn)不同濃度GSRd處理后，BDNF表達(dá)量

17、增加（P＜0.05或P＜0.01），提示體外GSRd的神經(jīng)保護(hù)作用可能通過增加BDNF的表達(dá)實(shí)現(xiàn)。
　　6. Western blot方法分析BDNF表達(dá)調(diào)控的上游組蛋白修飾機(jī)制，結(jié)果顯示，CCH損傷后，與假手術(shù)組相比，小鼠腦中p300/CBP、Ac-H3水平顯著下降（P＜0.01），而HDAC2表達(dá)水平升高（P＜0.01）；給予GSRd治療后，則能逆轉(zhuǎn)這些調(diào)控BDNF表達(dá)的上游蛋白的異常表達(dá)（P＜0.01）。
　　7.進(jìn)一

18、步采用培養(yǎng)神經(jīng)元OGD模型，確認(rèn)BDNF表達(dá)調(diào)控的上游組蛋白修飾機(jī)制，結(jié)果顯示，與對照組相比，OGD/R組神經(jīng)元Ac-H3表達(dá)水平顯著下降（P＜0.01），而HDAC2表達(dá)水平顯著上升（P＜0.01）；GSRd處理后則可逆轉(zhuǎn)這些上游蛋白的異常表達(dá)（P＜0.01）。
　　8.ChIP法結(jié)果顯示，OGD損傷促進(jìn)HDAC2與BDNF啟動子IV區(qū)域的結(jié)合，而降低Ac-H3與BDNF啟動子IV區(qū)域的結(jié)合，導(dǎo)致BDNF的表達(dá)顯著降低；給予GS

19、Rd處理后則可促進(jìn)Ac-H3、降低HDAC與BDNF啟動子IV區(qū)域的結(jié)合，使BDNF的表達(dá)恢復(fù)正常；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，預(yù)先給予HDAC的抑制劑MS-275，則可增強(qiáng)GSRd介導(dǎo)的該效應(yīng)。該結(jié)果提示，OGD損傷條件下，BDNF的表達(dá)受到組蛋白修飾的調(diào)節(jié)。
　　結(jié)論：
　　1.GSRd改善CCH導(dǎo)致的學(xué)習(xí)記憶障礙，并減輕CCH小鼠PFC和Hipp神經(jīng)元的凋亡，該效應(yīng)與CCH小鼠腦內(nèi)BDNF表達(dá)增加相關(guān)；BDNF的表達(dá)受到P300/

20、CBP、Ac-H3和 HDAC2參與的組蛋白乙?；恼{(diào)節(jié)。故GSRd通過表觀遺傳學(xué)調(diào)控BDNF的表達(dá)，保護(hù)CCH時神經(jīng)元免受損傷，從而改善空間記憶能力。
　　2.體外研究證實(shí)，暴露于OGD/R導(dǎo)致神經(jīng)元活力喪失，GSRd則對培養(yǎng)神經(jīng)元起到神經(jīng)保護(hù)作用。GSRd通過上調(diào)BDNF的表達(dá)，降低了OGD/R誘導(dǎo)的細(xì)胞活力喪失和LDH釋放，這與形態(tài)分析和凋亡的Caspase-3指標(biāo)一致。OGD/R處理足以增加HDAC2、減少Ac-H3，同時

21、伴隨BDNF表達(dá)的下降；GSRd處理可逆轉(zhuǎn)上述種種變化，提示 GSRd可能通過重建Ac-H3與HDAC2之間的平衡，參與BDNF轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，促進(jìn)神經(jīng)元存活。
　　3. BDNF啟動子IV區(qū)域受到組蛋白修飾機(jī)制的調(diào)控，作為HDAC的抑制劑——MS-275，與GSRd之間具有協(xié)同作用。
　　上述結(jié)果提示，在CCH小鼠模型中，GSRd提供神經(jīng)保護(hù)作用可能是通過組蛋白乙酰化修飾機(jī)制對BDNF進(jìn)行調(diào)控而實(shí)現(xiàn)的，從而揭示了GSRd神經(jīng)保護(hù)