化痰降濁方對(duì)高脂血癥痰濁證ApoE---小鼠microRNA-33調(diào)控脂質(zhì)代謝機(jī)制的研究.pdf

1、目的：
　　采用高脂飼料喂養(yǎng)復(fù)制大鼠高脂血癥痰濁證動(dòng)物模型進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，對(duì)其穩(wěn)定性及可重復(fù)性進(jìn)行評(píng)價(jià)，在掌握SD大鼠高脂血癥痰濁證“病證結(jié)合”動(dòng)物模型的基礎(chǔ)上，以ApoE-/-小鼠動(dòng)物模型為研究對(duì)象，采用化痰降濁方進(jìn)行干預(yù)，通過(guò)定量分析miR-33及其靶基因ABCA1、ABCG1及HMGCR和相應(yīng)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，揭示化痰降濁方通過(guò)miR-33調(diào)控高脂血癥痰濁證脂質(zhì)代謝的作用機(jī)制。
　　方法：
　?。ㄒ唬└咧Y痰濁證大

2、鼠“病證結(jié)合”動(dòng)物模型的復(fù)制和預(yù)試驗(yàn)
　　以復(fù)制高脂血癥痰濁證大鼠動(dòng)物模型作為預(yù)實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)高脂血癥痰濁證“病證結(jié)合”動(dòng)物模型的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。
　　1.SD大鼠高脂血癥痰濁證“病證結(jié)合”動(dòng)物模型穩(wěn)定性評(píng)價(jià)
　　將30只8周齡雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常組和模型組，正常組和模型組分別采用普通飼料和高脂飼料喂養(yǎng)，于喂養(yǎng)后的第4、6、8周末分別進(jìn)行眼眶后靜脈叢取血，檢測(cè)血清中的TC、TG、LDL-C、HDL-C的水平，于第8周

3、末處死后取肝臟及主動(dòng)脈制作HE染色病理切片，記錄整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中各組的飲食、飲水、體重等一般情況，評(píng)價(jià)成模情況及模型的穩(wěn)定性。
　　2.大鼠高脂血癥痰濁證“病證結(jié)合”動(dòng)物模型重復(fù)性評(píng)價(jià)
　　將16只8周齡雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常組和模型組，分別采用普通飼料和高脂飼料喂養(yǎng)8周，記錄各組大鼠的飲食、飲水、體重等一般情況，于第8周末行眼眶后靜脈叢取血后處死，檢測(cè)血清血脂四項(xiàng)水平，與第一次實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析，評(píng)價(jià)模型可重復(fù)性。

4、>　?。ǘ┗到禎岱綄?duì)高脂血癥痰濁證ApoE-/-小鼠microRNA-33調(diào)控脂質(zhì)代謝機(jī)制的研究
　　將50只ApoE-/-小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組8只和高脂飼料組42只，分別采用普通飼料和高脂飼料喂養(yǎng)，在第4周末，檢測(cè)所有小鼠的血脂四項(xiàng)水平，按TC值將高脂喂養(yǎng)組小鼠隨機(jī)分為模型組、中藥低劑量組、中藥中劑量組、中藥高劑量組、西藥組，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中記錄各組小鼠的飲水量、飲食量、體重等一般情況。按相應(yīng)的給藥方案給藥4周后，取血檢測(cè)血清血

5、脂四項(xiàng)水平，取肝臟及主動(dòng)脈制作HE染色病理切片，肝臟組織做Q-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-33、ABCA1、ABCG1及HMGCR基因的表達(dá)量，western-blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肝臟中ABCA1、ABCG1及HMGCR蛋白的相對(duì)表達(dá)量。
　　結(jié)果：
　?。ㄒ唬└咧Y痰濁證大鼠“病證結(jié)合”動(dòng)物模型的復(fù)制和預(yù)試驗(yàn)結(jié)果
　　1.大鼠高脂血癥痰濁證“病證結(jié)合”動(dòng)物模型具有穩(wěn)定性
　　第4、6周末，模型組大鼠的體重、平均飲食量、

6、飲水量與正常組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。第8周末，模型組大鼠體重、飲水量高于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;模型組飲食量與正常組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但觀察模型組大鼠從6周末開(kāi)始有啃咬飼料的情況，實(shí)際進(jìn)食量少于正常組。
　　高脂飼料喂養(yǎng)SD大鼠4周后，模型組TC明顯升高，與正常組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;TG、LDL-C、HDL-C稍有升高，與正常組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

7、＞0.05）。模型組6周末TC水平與4周末水平比較稍有下降，兩者比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），與正常組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）;模型組6周末的TG、LDL-C、HDL-C水平與正常組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。8周末模型組血脂四項(xiàng)與正常組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果提示，高脂飼料喂養(yǎng)SD大鼠模型以TC升高為主要改變，在第4周末其水平最佳。
　　2.大鼠高脂血癥痰濁證“病證結(jié)合”動(dòng)物模型重復(fù)性評(píng)價(jià)<

8、br>　　高脂飼料喂養(yǎng)8周后，模型組的TC、TG、LDL-C均高于正常組，HDL-C低于正常組，血脂四項(xiàng)與正常組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示:高脂飼料喂養(yǎng)SD大鼠復(fù)制高脂血癥痰濁證動(dòng)物模型以造模4周較為合適，具有穩(wěn)定性和可重復(fù)性。本預(yù)實(shí)驗(yàn)所建立的方法和技術(shù)，為進(jìn)一步開(kāi)展ApoE-/-小鼠脂質(zhì)代謝調(diào)控機(jī)制的研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
　?。ǘ┗到禎岱綄?duì)高脂血癥痰濁證ApoE-/-小鼠micr

9、oRNA-33調(diào)控脂質(zhì)代謝機(jī)制研究結(jié)果
　　1.各組小鼠的一般情況
　　造模第4周末，各組小鼠的自主活動(dòng)能力、對(duì)外界刺激的反應(yīng)度等與造模前比較無(wú)明顯變化;正常對(duì)照組體重、平均飲水量，與高脂喂養(yǎng)模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）;高脂喂養(yǎng)模型組平均飲食量減少，與正常對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果提示:4周末時(shí)高脂喂養(yǎng)組已具備高脂血癥痰濁證動(dòng)物模型的特點(diǎn)。
　　開(kāi)始給藥后，各組小鼠的主動(dòng)活動(dòng)頻

10、率均有減少，以中藥低、中、高劑量組較為明顯;給藥4周結(jié)束后，觀察各組飲食量發(fā)現(xiàn)，中藥中劑量組平均飲食量增多，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05);觀察各組飲水量發(fā)現(xiàn)，中藥低、中、高劑量組的平均飲水量減少，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;中藥高劑量組小鼠的終末體重降低，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其余各組小鼠體重與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　2.各組小鼠血脂四項(xiàng)水

11、平
　　經(jīng)過(guò)4周高脂喂養(yǎng)造模結(jié)束后，各組高脂喂養(yǎng)小鼠的血脂四項(xiàng)水平明顯升高，與正常對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），提示高脂血癥模型復(fù)制成功。高脂喂養(yǎng)各組間血脂四項(xiàng)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示各組間血脂水平基線一致，具有可比性。正常對(duì)照組的TC、TG、 LDL-C在給藥前后水平都明顯低于模型組，結(jié)果提示高脂飼料能促進(jìn)ApoE-/-小鼠血脂水平升高，能成功建立高脂血癥模型，與高脂喂養(yǎng)4周的SD大鼠的血脂水平比

12、較，ApoE-/-小鼠的血脂水平顯著升高（P＜0.05）。
　　給藥4周后，西藥組的TC、TG、LDL-C水平均降低，HDL-C水平升高，與給藥前及模型組比較，療效顯著。中藥治療組的療效參差不齊，中藥高劑量組的TG治療后明顯下降，其療效與西藥相當(dāng)，但大部分指標(biāo)與治療前及模型組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　3.肝臟和主動(dòng)脈病理切片結(jié)果
　　給藥4周后，各組小鼠的肝臟濕重與肝系數(shù)與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)意

13、義（P＞0.05）。中藥低中高劑量組、西藥組肝系數(shù)增大，與正常對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。高脂喂養(yǎng)組的肝臟脂肪變表現(xiàn)為脂肪空泡數(shù)量較多，大小不一，部分細(xì)胞核偏向一側(cè)，部分可見(jiàn)點(diǎn)狀壞死及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，隨著中藥給藥濃度的升高，肝臟脂肪化的程度逐漸減輕。各組主動(dòng)脈內(nèi)膜、中膜、外模結(jié)構(gòu)輕微紊亂，平滑肌排列輕度不規(guī)則。
　　4.各組小鼠miR-33、ABCA1、ABCG1、HMGCR基因和相應(yīng)蛋白的表達(dá)
　　中藥低劑

14、量組、中藥高劑量組、西藥組的miR-33基因水平下降，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;中藥高劑量組的ABCG1、HMGCR基因表達(dá)水平下降，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　ABCA1、ABCG1、HMGCR蛋白水平各組與模型組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。
　　結(jié)論：
　　（一）高脂飼料喂養(yǎng)SD大鼠復(fù)制高脂血癥痰濁證動(dòng)物模型以4周為宜，具有穩(wěn)定性和可重復(fù)性，所建立的方法和

15、技術(shù)，為進(jìn)一步開(kāi)展ApoE-/-小鼠脂質(zhì)代謝調(diào)控機(jī)制研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
　?。ǘ┏醪教剿鹘⒏咧Y痰濁證“病證結(jié)合”動(dòng)物模型評(píng)價(jià)指標(biāo)，主要包括:①血脂水平異常;②肥胖;③倦怠;④飲食量與飲水量減少。
　　（三）高脂飼料喂養(yǎng)能加速ApoE-/-小鼠血脂紊亂，血脂水平顯著升高?；到禎岱侥芸刂艫poE-/-小鼠的血脂水平，血脂四項(xiàng)在給藥期間均維持造模結(jié)束后的水平，其中中藥高劑量組療效最佳，能減輕小鼠體重，改善厭食情況。<