LC3B基因啟動(dòng)子在心肌梗死病人中的遺傳和功能變異研究.pdf

1、目的:研究心肌梗死病人和健康人群中LC3B基因啟動(dòng)子序列變異情況，針對(duì)變異序列構(gòu)建重組質(zhì)粒，通過檢測(cè)雙熒光素酶的活性，對(duì)LC3B基因啟動(dòng)子進(jìn)行功能分析，探討LC3B基因啟動(dòng)子序列變異與心肌梗死關(guān)聯(lián)的生物學(xué)實(shí)質(zhì)，為心肌梗死的遺傳學(xué)分析提供理論依據(jù)，為臨床上心肌梗死的預(yù)防、診斷、治療提供新的思路。
　　方法:采用大樣本的病例對(duì)照研究方法對(duì)LC3B基因啟動(dòng)子進(jìn)行基因序列分析和功能測(cè)定，收集就診于濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院經(jīng)診斷為急性心肌梗死的病

2、人383例，同期于濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院體檢的人群中隨機(jī)選取390例健康人為對(duì)照組，性別、年齡在兩組間無顯著差異，分別統(tǒng)計(jì)兩組人群的臨床資料。分別從病人組和對(duì)照組人群外周血中提取基因組DNA，根據(jù)LC3B基因的基因組序列，設(shè)計(jì)合成LC3B基因啟動(dòng)子引物，采用普通PCR方法擴(kuò)增兩組人群中LC3B基因啟動(dòng)子序列，對(duì)DNA序列直接測(cè)序，分析兩組人群中LC3B基因啟動(dòng)子序列變異情況。構(gòu)建含LC3B基因啟動(dòng)子序列變異位點(diǎn)的pMD19-T載體，擴(kuò)增后酶

3、切和測(cè)序鑒定，亞克隆LC3B基因啟動(dòng)子序列至pGL3-Basic螢火蟲熒光素酶報(bào)告基因載體，聯(lián)同PRL-TK海腎熒光素酶報(bào)告基因載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞和H9C2細(xì)胞，收集細(xì)胞裂解液后，采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)兩種細(xì)胞中螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性，初步探討LC3B基因啟動(dòng)子序列變異對(duì)其轉(zhuǎn)錄活性的影響，及在H9C2細(xì)胞和HEK293細(xì)胞中的差異性轉(zhuǎn)錄活性。
　　結(jié)果:1.該研究人群中發(fā)現(xiàn)25個(gè)DNA序列變異(

4、DSVs)，其中有12個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNPs)。在心肌梗死病人中，發(fā)現(xiàn)7個(gè)新穎DSVs，分別為g.4107T＞A, g.4325G＞C, g.4445delG, g.4597C＞G, g.4891C＞A, g.4903G＞T, g.4938C＞T和3個(gè)SNPs, g.4137C＞T(rs575567442), g.4208C＞T(rs111626199)和g.4853A＞G(rs77019223)。而這些DSVs在對(duì)照組中沒有發(fā)現(xiàn)。

5、在對(duì)照組人群中，發(fā)現(xiàn)5個(gè)新穎雜合DSVs:g.4106C＞T，g.4224T＞C，g.4889C＞G，g.4904C＞G，g.5001A＞C，和2個(gè)SNPs: g.4175G＞C(rs543058021), g.4494A＞C(rs577616524)，這7個(gè)DSVs只在對(duì)照組中出現(xiàn)。其他8個(gè)DSVs，包括7個(gè)SNPs:g.4068G＞A(rs552929429), g.4280C＞T(rs11117269), g.4282C＞T(rs

6、532744297), g.4433G＞A(rs142738317), g.4631C＞G(rs35227715), g.4774G＞A(rs189170289), g.4883C＞A(rs16944733)，和1個(gè)新穎DSV:g.4488G＞C，在MI組和對(duì)照組中均有出現(xiàn)，且出現(xiàn)頻率在兩組中無區(qū)別(P＞0.05)。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)g.4883C＞A(rs16944733)和g.4889C＞G在發(fā)生頻率上緊密連鎖。2.在體外培養(yǎng)的HE

7、K293細(xì)胞和H9C2細(xì)胞中，g.4107T＞A, g.4325G＞C, g.4597C＞G, g.4891C＞A, g.4903G＞T, g.4938C＞T和g.4137C＞T(rs575567442)，g.4853A＞G(rs77019223)，均能降低LC3B基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性(P＜0.05)，未發(fā)現(xiàn)其他DSVs和SNPs改變LC3B基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性(P＞0.05)。
　　結(jié)論:LC3B基因啟動(dòng)子序列變異可能改變其轉(zhuǎn)錄