牛Sry基因核心啟動(dòng)子定位及其基因功能研究.pdf

1、Sry基因主導(dǎo)哺乳動(dòng)物雄性性別決定和睪丸的起始發(fā)育。轉(zhuǎn)基因鼠證明Sry可以誘導(dǎo)XX型小鼠向雄性發(fā)育。Sry蛋白含有一段可以結(jié)合DNA的區(qū)域，被稱為HMG-box。HMG-box在哺乳動(dòng)物不同物種間相對(duì)保守，人SRYHMG-box區(qū)域相應(yīng)位置的點(diǎn)突變可以引起性別反轉(zhuǎn)。對(duì)人SRY的亞細(xì)胞定位研究結(jié)果表明其分布在Sertoli細(xì)胞細(xì)胞核內(nèi)，推測(cè)其發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子作用。目前，Sry的表達(dá)調(diào)控機(jī)制依然不清楚。鼠Sry在XY型胚胎生殖嵴Sertoli前

2、體細(xì)胞中表達(dá)，并受到嚴(yán)格的時(shí)空限制，但在其他物種并不十分嚴(yán)格，如人、羊在成年雄性的睪丸內(nèi)依然可以檢測(cè)到其表達(dá)。雖然已證明sry具有誘導(dǎo)睪丸發(fā)育的功能，但其下游目的基因仍然無(wú)法確定。Sox9是Sry可能的下游基因之一。Sf1(sleroidogenicfator-1)、Gata4(GATAbindingprotein4)、Wt1(Wilms’tumorgene)、Sox9(Sry-relatedHMGbox-9)、Amh(AntiMull

3、erianHormone)和Dax1(Dosagesensitivesexreversallocus-1)也被證明在性別決定過(guò)程中有重要作用。目前關(guān)于哺乳動(dòng)物Sry基因的大量研究主要集中在人和鼠上，在其他動(dòng)物上的研究較少。牛作為重要的經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，在畜牧業(yè)生產(chǎn)中具有重要價(jià)值，奶牛繁殖時(shí)產(chǎn)生的半數(shù)雄性牛，經(jīng)濟(jì)價(jià)值很低，目前采用的性別控制技術(shù)，主要是依據(jù)X精子和Y精子DNA含量上的微小差別，以流式細(xì)胞技術(shù)分離，存在價(jià)格昂貴，分離效率低，及所分離

4、的精子受精率低等問(wèn)題。闡明牛性別控制相關(guān)基因的調(diào)控模式，有希望在分子水平上干擾性別決定的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，可以為奶牛性別控制提供新的思路；也可為哺乳動(dòng)物性別分化的比較生物學(xué)研究填補(bǔ)牛相關(guān)數(shù)據(jù)的空白。 本試驗(yàn)對(duì)牛Sry基因進(jìn)行了結(jié)構(gòu)與功能的研究，主要內(nèi)容包括：克隆了牛Sry基因包含5’側(cè)翼和編碼區(qū)在內(nèi)的1838bp序列；原代分離培養(yǎng)牛生殖嵴細(xì)胞及卵巢顆粒細(xì)胞，并對(duì)生殖嵴細(xì)胞進(jìn)行性別鑒定及特征鑒定；利用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)牛Sry5’側(cè)翼10

5、66bp內(nèi)潛在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)TSS及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，比較10個(gè)物種SRY/Sry蛋白同源性及趨異分化程度，并進(jìn)行物種進(jìn)化分析，比較牛及人SRY蛋白的三維結(jié)構(gòu)；構(gòu)建不同長(zhǎng)度的缺失牛Sry5’側(cè)翼序列調(diào)控的報(bào)告基因載體，利用熒光素酶雙報(bào)告基因分析系統(tǒng)在生殖嵴細(xì)胞內(nèi)研究牛Sry核心啟動(dòng)子區(qū)域位置；構(gòu)建了pcDNA3.1-Sty表達(dá)載體，在生殖嵴細(xì)胞和卵巢顆粒細(xì)胞中進(jìn)行了Sry過(guò)表達(dá)，利用半定量RT-PCR對(duì)性別控制相關(guān)基因在Sry過(guò)表達(dá)前后的

6、表達(dá)水平變化進(jìn)行檢測(cè)，包括Sf1、Gata4、Wt1，Sox9、Amh和Dax1;構(gòu)建pEGFP-N1-Sry亞細(xì)胞定位表達(dá)載體，其可以表達(dá)融合蛋白(Sry-GFP)，在牛生殖嵴細(xì)胞和卵巢顆粒細(xì)胞中進(jìn)行了Sry亞細(xì)胞定位研究。主要結(jié)論如下： 1.克隆了牛Sry基因包括5’側(cè)翼及編碼區(qū)(ORF)在內(nèi)的1838bp序列，通過(guò)測(cè)序及序列比對(duì)，結(jié)果和GenBank中牛Sry序列(NoAB039748.1)完全一致。 2.原代分離

7、培養(yǎng)牛生殖嵴細(xì)胞，對(duì)其進(jìn)行鑒定表明，此細(xì)胞為處于性別分化時(shí)期的雄性生殖嵴細(xì)胞，在體外生長(zhǎng)狀態(tài)良好，可以穩(wěn)定傳代，為后繼研究奠定了基礎(chǔ)。 3.原代分離培養(yǎng)牛卵巢顆粒細(xì)胞，經(jīng)過(guò)在體外傳代觀察，細(xì)胞形態(tài)均一，在體外生長(zhǎng)狀態(tài)良好，可以穩(wěn)定傳代，為后繼研究奠定了基礎(chǔ)。 4.對(duì)牛Sry5’端1066bp序列的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，分別在-93、-419、-722(ATG中A為0點(diǎn))位置存在三個(gè)潛在的轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)(TSS)，而且這段區(qū)域含

8、有非常豐富的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)信息，這和Sry基因表達(dá)的特異性、復(fù)雜性相一致。 5.10個(gè)物種SRY/Sry蛋白序列比較結(jié)果表明，牛和山羊Sry蛋白同源性最高，達(dá)到93.5％；牛和小鼠Sry蛋白趨異分化程度最高，達(dá)60.4％。 6.進(jìn)化分析表明牛與羊在親緣關(guān)系上最為接近，歸為一類，在比較的10個(gè)物種中是處于進(jìn)化最遠(yuǎn)的亞類，表明偶蹄目動(dòng)物Sry基因在進(jìn)化上受自然選擇的影響有較大的變異。 7.比較牛和人SRY蛋白結(jié)構(gòu)，

9、僅在保守區(qū)HMG-box處有較高的相似性，但是空間構(gòu)象卻比較相似，都是通過(guò)結(jié)合DNA螺旋小溝來(lái)識(shí)別7個(gè)堿基的核心靶序列，作用方式也很相似，說(shuō)明雖然SRY/Sry蛋白在物種間序列差異較大，但蛋白的結(jié)構(gòu)和作用方式卻是很保守的。 8.在生殖嵴細(xì)胞內(nèi)，利用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)，用13個(gè)缺失表達(dá)載體，對(duì)牛Sry5’側(cè)翼1056bp啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行了細(xì)致掃描，結(jié)果表明牛Sry核心啟動(dòng)子位于翻譯起始位點(diǎn)ATG(A為0點(diǎn))上游-599～-5

10、65bp一段35bp大小的區(qū)域內(nèi)。 9.利用pcDNA3.1-Sry表達(dá)載體在牛生殖嵴細(xì)胞內(nèi)過(guò)量表達(dá)Sry，用RT-PCR檢測(cè)性別發(fā)育相關(guān)基因Sry過(guò)表達(dá)前后表達(dá)水平變化，包括Sf1、Gata4、Wt1、Sox9、Amh和Dax1，結(jié)果證明牛Sry對(duì)Sox9表達(dá)有正調(diào)控作用，而其他基因不受Sry過(guò)表達(dá)影響。 10.利用pEGFP-N1-Sry融合蛋白表達(dá)載體(Sry-GFP)在牛生殖嵴細(xì)胞和卵巢顆粒細(xì)胞中研究Sry的細(xì)胞