膽堿和阿司匹林協(xié)同抗炎作用及其藥理學機制的研究.pdf

1、關節(jié)炎、膿毒癥、潰瘍性結(jié)腸炎、動脈粥樣硬化等一系列慢性進展性炎性疾病嚴重威脅人類健康。隨著世界人口老齡化等問題的凸顯，此類頑固性疾病的發(fā)病率也逐年升高，形勢非常嚴峻，這已經(jīng)成為非常令人關注的公共衛(wèi)生問題之一。由于炎癥反應涉及眾多細胞因子和炎癥介質(zhì)的參與，目前針對此類疾病的治療仍然是一個非常棘手的問題。非甾體類抗炎藥（non-steroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs）由于具有確切的鎮(zhèn)痛抗炎作用，一直

2、是各國推薦用于治療關節(jié)炎的一線用藥。但它們僅能改善炎癥癥狀，并不能延緩疾病的進展，而且嚴重的胃腸道副作用限制了其臨床應用。更為不幸的是，目前所有的抗炎藥物用于治療膿毒癥這種失控性全身炎癥反應的效果均被證明是無效的。因此，臨床上可用的抗炎藥物還遠遠不能滿足治療頑固性炎性疾病的需求，尋找新的抗炎靶點，研發(fā)更加安全有效的抗炎技術途徑具有重要的價值。
　　已經(jīng)公認，激活α7煙堿樣乙酰膽堿受體（α7受體）是治療一系列難治性炎癥疾病的重要策略

3、。因為采用藥理學途徑激活α7受體可以顯著抑制免疫細胞/內(nèi)皮細胞合成和釋放腫瘤壞死因子(TNF-α)、白介素、和高遷移率族蛋白1(HMGB1)等促炎細胞因子。在“靶向α7受體抗炎通路”這一研究領域內(nèi)，膽堿是其中一個非常有發(fā)展前景的候選藥物。因為膽堿是天然的α7受體選擇性激動劑。同時，膽堿是機體必需的營養(yǎng)物質(zhì)之一，是細胞膜卵磷脂和鞘磷脂的重要組成部分，是體內(nèi)合成乙酰膽堿的前體物質(zhì)和重要的甲基來源，口服安全無毒。有研究報道膽堿在不同的炎性疼痛

4、模型上具有鎮(zhèn)痛作用;在實驗性膿毒癥模型上也證實其具有保護作用;此作用與其激活α7受體有關。然而，膽堿對非感染性急性炎癥是否具有抗炎性腫脹作用還不清楚;膽堿對于膿毒癥的防治效果尚缺乏系統(tǒng)的研究。
　　以臨床上抗炎療效確切的藥物為基礎，采用藥物聯(lián)用的方案，是開發(fā)新的抗炎技術途徑的現(xiàn)實手段之一。阿司匹林是經(jīng)典的NSAIDs。雖然阿司匹林大劑量使用會導致胃腸道副作用，但小劑量的阿司匹林卻一直廣泛用于防治伴有炎癥和血液高凝狀態(tài)的心血管疾病病

5、人，而且業(yè)已證明其長期服用的有效性和安全性。值得關注的是，近年來的研究表明阿司匹林在抗炎方面比其他NSAIDs可能具有更多的治療學優(yōu)勢。一方面，阿司匹林可以通過環(huán)氧合酶依賴和非依賴的分子途徑發(fā)揮抗炎作用，表現(xiàn)在:(1)促進抗炎物質(zhì)Aspirin-triggered lipoxins(ATLs)的釋放，增加了巨噬細胞的吞噬功能;(2)對各種免疫細胞均具有免疫調(diào)節(jié)作用，有利于治療具有自身免疫反應特點的疾病等。另一方面，高選擇性環(huán)氧合酶-2抑

6、制劑的抗炎效果非但并不優(yōu)于阿司匹林，而且有增加致死性心血管事件的風險。因此，阿司匹林在NSAIDs中仍占有重要地位。尋找一種具有不同作用機制的抗炎藥物與阿司匹林聯(lián)用將有可能達到增強其抗炎療效，降低其使用劑量，從而降低劑量相關副作用的目的。由于膽堿可以通過激活α7受體抑制多種促炎細胞因子的釋放，而阿司匹林也具有多條抗炎分子途徑，理論上二者聯(lián)用能夠發(fā)揮更好的抗炎作用。有趣的是，本實驗室前期研究表明，在不同的炎性疼痛模型上，膽堿能增強低劑量的

7、阿司匹林的鎮(zhèn)痛效應。因此，我們推測膽堿與低劑量阿司匹林具有協(xié)同抗炎作用，這可能是一個更加安全有效的抗炎途徑。圍繞這一工作假設，本論文第一章在角叉菜膠誘導的小鼠足趾腫脹模型上，以腫脹度為指標，評價了膽堿在急性非感染性局部炎癥反應模型上的抗炎作用，并采用等輻射分析法研究了膽堿和阿司匹林聯(lián)用的交互作用類型及其與α7受體的關系。本論文第二章在LPS誘導的小鼠膿毒癥模型（全身失控性炎癥反應模型）上，以生存時間和存活率為指標，系統(tǒng)研究了膽堿對全身炎

8、癥反應/膿毒癥防治作用的最佳療效;研究了膽堿與阿司匹林聯(lián)用對膿毒癥小鼠的防治效果及其與α7受體的關系;并探討了二者聯(lián)用對細胞因子和炎癥介質(zhì)釋放的影響。
　　主要研究結(jié)果如下:
　　1.膽堿以及膽堿和阿司匹林聯(lián)用抑制λ-角叉菜膠所致足趾炎性腫脹的藥理學特征
　　小鼠足趾底部注射1％λ-角叉菜膠后1，2，3，4，5，和6h，足趾腫脹度(％，mean±S.E.M)分別為12.7±1.3％，17.5±1.5％，22.1±2.1

9、％，19.8±2.O％，17.2±1.8％，和16.0±2.2％。角叉菜膠注射后1～3h為急性炎性腫脹的發(fā)展期，4～6h為緩慢消退期，其中角叉菜膠注射后3h小鼠足趾腫脹達峰值。因此，選擇角叉菜膠注射后1～3h為主要觀測時間，并以3h這一時間點的腫脹度來計算藥物作用的ED50值。
　　阿司匹林11.25～200 mg/kg腹腔注射預防1h可以劑量依賴性抑制足趾腫脹的程度。在角叉菜膠注射后3h，以模型組的平均腫脹度為100％，則阿司匹

10、林11.25，22.5，45，100，和200 mg/kg給藥后的相對腫脹率分別為:94.6％，93.8％，72.0％，54.8％，和43.7％;ED50為136.73 mg/kg（95％可信區(qū)間:87.41～213.87）。
　　膽堿12.5～80 mg/kg腹腔注射預防3h也可以劑量依賴性抑制小鼠足趾炎性腫脹程度。在角叉菜膠注射后3h，以模型組的平均腫脹度為100％，則膽堿12.5，25，50，和80 mg/kg給藥后的相對腫

11、脹率分別為:91.1％，73.9％，70.5％，和66.9％; ED50為＞200.31mg/kg(95％可信區(qū)間:75.07～534.48)。
　　單獨給予膽堿12.5 mg/kg和阿司匹林11.25 mg/kg均無顯著的抗腫脹作用，但兩者聯(lián)用時可以顯著抑制足趾腫脹的程度，提示兩者可能具有協(xié)同作用。在兩藥聯(lián)用時的量-效關系研究中，我們根據(jù)等輻射分析法的原則，在維持兩藥這一固定劑量比例的條件下，采用劑量分別倍增/倍減的方式，設計了

12、如下5個劑量組，即膽堿3.125 mg/kg+阿司匹林2.8 mg/kg、膽堿6.25 mg/kg+阿司匹林5.625 mg/kg、膽堿12.5mg/kg+阿司匹林11.25mg/kg、膽堿25 mg/kg+阿司匹林22.5 mg/kg、和膽堿50 mg/kg+阿司匹林45 mg/kg。結(jié)果表明，兩藥聯(lián)用可以劑量依賴性抑制足趾腫脹的程度。以模型組的平均腫脹度為100％，聯(lián)合給藥各劑量組在角叉菜膠注射后3h小鼠的足趾相對腫脹度分別為83.

13、2％、71.5％、59.7％、46.3％、和34.7％，據(jù)此計算得到兩藥聯(lián)用時膽堿和阿司匹林的ED50分別為21.31 mg/kg(19.73～23.04)和19.19 mg/kg(17.76～20.73)。采用CalcuSyn2.0軟件分析得出膽堿和阿司匹林聯(lián)用的量-效曲線較分別單用時顯著左移，提示兩藥聯(lián)用既可以降低使用劑量，又可以提高抗炎效應。膽堿和阿司匹林聯(lián)用時，在ED50，ED75，和ED90處的聯(lián)合用藥指數(shù)(Combinati

14、on index，CI)值分別為0.25，0.32，和0.44。由于CI值＜0.9為協(xié)同效應，＜0.5為強協(xié)同效應，因此判斷兩藥聯(lián)用具有很強的協(xié)同抗炎效應。
　　選擇性α7受體拮抗劑MLA5 mg/kg腹腔注射預防給藥并不影響λ-角叉菜膠所致的足趾腫脹，但可以完全拮抗50 mg/kg的膽堿對足趾腫脹的抑制作用。MLA2 mg/kg可以拮抗膽堿12.5 mg/kg和阿司匹林11.25 mg/kg聯(lián)用時對足趾腫脹的協(xié)同抑制作用。這表明

15、單獨給予膽堿抑制炎性腫脹的機制主要由激活α7受體介導;同時α7受體的激活參與了膽堿和阿司匹林的協(xié)同抗炎效應。
　　2.膽堿以及膽堿和阿司匹林聯(lián)用對抗LPS誘導的膿毒癥的藥理學特征
　　50 mg/kg的LPS靜脈注射能成功建立失控性全身炎癥反應（重度膿毒癥）小鼠模型，動物在24小時內(nèi)死亡率接近100％。單次預防給予膽堿10～50 mg/kg對膿毒癥小鼠生存時間和死亡率均無顯著影響;膽堿60，70，和80 mg/kg給藥后可顯

16、著延長小鼠的中位生存期，存活率分別為30％，20％，和20％;其中以膽堿60 mg/kg預防給藥效果最佳。
　　單次預防給予阿司匹林10和20 mg/kg對膿毒癥小鼠的生存曲線并無明顯影響;預防給予阿司匹林40和60 mg/kg后，膿毒癥小鼠的中位生存期顯著延長;阿司匹林10～60mg/kg預防給藥后，模型動物的存活率分別為0％，10％，10％，10％;提示阿司匹林僅能減輕炎癥反應，延緩死亡，但在提高膿毒癥小鼠的存活率方面效果甚微

17、。當阿司匹林的劑量高達100 mg/kg時，其保護作用則完全消失，與文獻報道一致。
　　單用阿司匹林20 mg/kg和單用膽堿40 mg/kg對膿毒癥小鼠均無顯著影響，但兩者聯(lián)用卻可以顯著提高存活率(60％)，利用Cox比例風險回歸模型進行統(tǒng)計分析表明，二者存在顯著的交互作用，提示兩藥預防聯(lián)用時具有協(xié)同增強效應。
　　采用正交設計的方法得到膽堿治療膿毒癥的最佳方案為40 mg/kg間隔2h給藥3次，但存活率也僅能提高到30％

18、。而阿司匹林7.5～100 mg/kg單用治療的結(jié)果跟預防給藥的結(jié)果類似。雖然膽堿最佳治療方案和阿司匹林聯(lián)合用藥治療膿毒癥小鼠時并未發(fā)現(xiàn)協(xié)同作用，但在存活率方面，兩藥聯(lián)用均高于單用，提示兩藥聯(lián)用治療膿毒癥時有疊加作用。
　　預防給予2 mg/kg MLA本身并不影響模型小鼠的生存時間和存活率，但可以完全阻斷60 mg/kg膽堿對模型小鼠的保護作用，說明膽堿對膿毒癥小鼠的治療作用是通過激活α7受體介導的。2 mg/kg MLA可以拮

19、抗膽堿40 mg/kg和阿司匹林20 mg/kg聯(lián)用的抗膿毒癥效果，證明α7受體的激活參與了兩藥的協(xié)同保護作用。
　　文獻報道，無論是角叉菜膠還是LPS所致的炎癥反應，在病理生理機制上均歸咎于促炎細胞因子和炎癥介質(zhì)的大量釋放。因此，我們研究了膽堿40 mg/kg和阿司匹林20mg/kg單用或聯(lián)用對LPS所致全身炎癥反應小鼠血清細胞因子和炎癥介質(zhì)的影響。膽堿40 mg/kg可以顯著抑制LPS誘導的血中TNF-α、IL-1β、IL-6

20、、HMGB1、TXA2、 PGI2、LTB4、和PGE2的病理性增高，但不影響IFN-γ和抗炎細胞因子IL-10的含量。而阿司匹林20 mg/kg可以顯著抑制IL-1β、IL-6、IL-10、TXA2、PGI2、LTB4、和PGE2的病理性增高，但不影響IFN-γ、TNF-α和HMGB1的含量。值得注意的是，兩者聯(lián)用時可以顯著抑制TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6、HMGB1、TXA2、PGI2、 LTB4、和PGE2的病理性

21、增高。兩藥聯(lián)用較分別單用可以更有效地抑制IFN-γ、IL-1β、IL-6、HMGB1和PGE2的釋放，表明膽堿和阿司匹林聯(lián)用時能更好地抑制LPS所致促炎細胞因子和炎癥介質(zhì)的釋放，更有效地控制機體的過度炎癥反應。
　　在離體培養(yǎng)的小鼠巨噬細胞系RAW264.7細胞上，我們進一步探討了如下兩個問題:(1)阿司匹林是否增強膽堿對細胞因子TNF-α的抑制作用;(2)膽堿是否增強阿司匹林對花生四烯酸代謝的抑制作用。
　　LPS(100

22、 ng/ml)刺激培養(yǎng)的RAW264.7細胞可致上清液中TNF-α的含量顯著升高，膽堿(1～50 mmol/L)可以劑量依賴性抑制TNF-α的釋放，與文獻報道一致;但100μmol/L的阿司匹林與50 mmol/L的膽堿聯(lián)用時卻并不增強膽堿對TNF-α的抑制作用，提示兩藥聯(lián)用的機制可能不是通過抑制TNF-α這一分子途徑。
　　LPS（1μg/ml）刺激培養(yǎng)的RAW264.7細胞可導致上清液中TXA2和PGI2的顯著升高，阿司匹林(

23、0.1～30μmol/L)可以劑量依賴性抑制TXA2和PGI2的釋放;但膽堿(0.1～10 mmol/L)并不影響TXA2和PGI2的含量;而且1mmol/L膽堿和阿司匹林聯(lián)用并不影響阿司匹林對TXA2和PGI2釋放的抑制作用。這提示膽堿并不直接抑制環(huán)氧合酶的活性，也不增強阿司匹林對環(huán)氧合酶活性的抑制作用。
　　由于阿司匹林的抗血小板作用源于其對TXA2的抑制作用而阿司匹林的胃腸道副作用源于其對PGI2的抑制作用，而膽堿本身并不直

24、接影響TXA2和PGI2的代謝，也不影響阿司匹林對TXA2和PGI2的抑制作用，提示兩藥聯(lián)用的情況下，膽堿在提高阿司匹林的抗炎效果和降低使用劑量的同時，既不會增加阿司匹林所致的胃腸道副作用也不會增加出血傾向，表明膽堿和低劑量阿司匹林聯(lián)用是更為安全有效的抗炎技術途徑。
　　綜上所述，本研究得出如下結(jié)論:
　　1.膽堿通過激活α7受體對局部和全身炎癥反應發(fā)揮顯著的抗炎作用。
　　2.膽堿和低劑量阿司匹林聯(lián)用具有協(xié)同抗炎作用