MORN4及NR4A2在缺血心肌凋亡中的作用及分子機制研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　急性心肌梗死等缺血性心臟病是致死率最高的疾病之一，其發(fā)病機理是冠狀動脈循環(huán)受阻導致供應到心臟的血液減少，心肌細胞由于營養(yǎng)缺乏而發(fā)生大量死亡，對心室造成不可逆的損傷。因此抑制缺血引起的心肌細胞凋亡，對于缺血性心臟疾病的治療非常重要。自噬增加是缺血心肌的另一重要病理現(xiàn)象，通過清除細胞內損傷細胞器或長壽蛋白來維持細胞生存所需基本能量，因此，適度的自噬對于細胞的存活是有益的，但過度的自噬可能會引發(fā)細胞死亡。自噬和凋亡

2、互相聯(lián)系形成復雜的關系網(wǎng)絡，影響自噬與凋亡的分子機制需要進一步研究。
　　我們前期的研究發(fā)現(xiàn)鞘氨醇磷酸膽堿(Sphingosylphosphorylcholine，SPC)能通過自噬抑制缺血心肌細胞的凋亡。SPC是一種生物活性鞘脂類，可以作為有效工具發(fā)現(xiàn)心肌細胞自噬和凋亡關聯(lián)的新因子。我們利用體外心肌細胞缺血模型結合基因芯片技術研究了SPC調控的基因，發(fā)現(xiàn)MORN4及NR4A2受到SPC的調控，可能是調節(jié)心肌細胞自噬和凋亡的重要因

3、子。
　　MORN4(the membrane occupation and recognition nexus repeats4 times)是包含4個MORN motif的蛋白。MORN motif廣泛存在于動物、植物和原生生物的蛋白中，數(shù)量從2-17不等，但對其功能所知甚少。研究發(fā)現(xiàn)MORN motif與蛋白的膜定位有關，如phosphatidylinositol phosphate kinase(PIPK)上的MORNmo

4、tif可將其定位在細胞膜上;而與葉綠體分裂相關的蛋白accumulation andreplication of chloroplast(ARC3)通過MORN motif定位到類囊體膜上。目前有關MORN4的報道更少，僅限于參與果蠅光敏反應的研究，MORN4是否在缺血心肌中發(fā)揮功能還不清楚。
　　NR4A2(Nuclear receptor subfamily4,group A, member2)也叫Nurr1，與NR4A1，N

5、R4A3組成NR4A孤核受體家族。NR4A家族屬即早期反應的轉錄因子，能夠迅速對環(huán)境的改變做出反應。已有研究表明，NR4A2參與到腫瘤，肥胖，糖尿病，特別是神經(jīng)類疾病的發(fā)生中，但是是否參與缺血性心臟病目前還不清楚。NR4A2在疾病中的功能與其調控分化，凋亡，遷移，增殖等有關，根據(jù)芯片結果我們推測NR4A2可能是參與心肌細胞凋亡的關鍵因子，目前，NR4A1參與細胞凋亡的研究已有較多報道，但是NR4A2與NR4A1在DNA結合區(qū)域和配體結合

6、區(qū)域的不同使得兩者功能不同，有關NR4A2的報道主要集中在肺癌細胞中，如:NR4A2在肺癌細胞中通過與p53結合抑制Bax的表達，抑制細胞凋亡。但是NR4A2是否參與心肌細胞的凋亡尚未見報道。
　　基于以上問題，本論文研究了MORN4及NR4A2在缺血心肌細胞自噬與凋亡中的作用，并進一步闡明了相關的作用機制。本論文的研究結果為缺血性心臟病的治療提供了新的藥物作用靶點。
　　研究結果：
　　1.SPC通過JNK/MORN

7、4/MFN2促進的自噬抑制缺血心肌細胞的凋亡
　　1.1.SPC上調MORN4的表達
　　去血清處理H9c2心肌細胞用以模擬心肌缺血的體內環(huán)境，并加入SPC檢測MORN4的變化。Western blot及免疫熒光顯示5μM SPC明顯上調MORN4的蛋白水平。熒光定量PCR驗證了5μM SPC上調MORN4的RNA水平。因此，SPC能夠上調MORN4的表達。
　　1.2.MORN4在缺血心肌細胞和心梗心臟中的表達升高<

8、br>　　為了明確MORN4是否參與心肌細胞缺血過程，我們檢測了MORN4在缺血心肌中的表達。Western blot顯示當缺血超過4h時，伴隨著凋亡maker PARP和caspase3切割的增加，MORN4的表達也顯著上調。體內實驗利用急性心梗模型進行驗證，western blot結果表明，與對照組相比，心梗模型中心臟組織的PARP和caspase3的切割明顯高于對照組，同時MORN4的表達明顯升高。QPCR結果與蛋白水平變化一致。

9、
　　1.3.干擾MORN4促進H9c2細胞和原代心肌細胞的凋亡
　　為了明確MORN4在缺血心肌細胞凋亡中的作用，我們利用MORN4的干擾RNA抑制MORN4的表達。瓊脂糖凝膠電泳，QPCR和免疫熒光結果表明80 nM的siRNA明顯降低MORN4的表達。Western blot結果表明MORN4敲減后H9c2細胞和原代心肌細胞凋亡marker PARP與caspase3的切割都增加。TUNEL染色結果表明干擾MORN4后

10、缺血導致的心肌細胞的凋亡進一步加劇。因此，干擾MORN4促進心肌細胞凋亡。
　　1.4.干擾MORN4抑制H9c2細胞和原代心肌細胞的自噬流
　　我們進而利用MORN4的干擾RNA探究MORN4在缺血心肌自噬中的作用。干擾MORN4后，western blot結果顯示心肌細胞LC3-Ⅱ蛋白水平明顯升高;熒光顯微鏡下觀察到轉入EGFP-LC3的心肌細胞中LC3點狀聚集明顯增多。為了分析LC3-Ⅱ增多的原因，我們利用了自噬起始的

11、抑制劑3-methyladenine(3MA)及自噬流的阻斷劑bafilomycin A1(Baf A1)。由于3MA和BafA1均沒有影響LC3-Ⅱ的蛋白水平，表明MORN4的siRNA通過阻斷缺血心肌細胞的自噬流導致了LC3-Ⅱ增多。
　　1.5.干擾MORN4通過阻斷自噬流促進心肌細胞凋亡
　　我們利用自噬流的阻斷劑Baf A1和自噬促進劑Rapamycin確認MORN4敲減導致的自噬流阻斷與細胞凋亡的關系。Weste

12、rn blot結果顯示Rapamycin促進自噬后抑制了MORN4敲減導致的心肌細胞凋亡，表明MORN4敲減導致的心肌細胞凋亡與自噬抑制有關;而Baf A1阻斷自噬流并沒有進一步影響心肌細胞凋亡的變化，表明MORN4敲減通過阻斷自噬流進而抑制自噬促進心肌細胞凋亡。
　　1.6.SPC通過MORN4抑制缺血心肌細胞的凋亡
　　我們接下來利用MORN4的干擾RNA檢測SPC是否通過MORN4保護心肌細胞凋亡。Western bl

13、ot結果顯示干擾MORN4后逆轉了SPC降低的PARP和caspase3的切割。因此，SPC通過MORN4保護心肌細胞凋亡。
　　1.7.SPC通過MORN4與mitofusion2(MFN2)的相互作用促進自噬
　　Western blot結果表明缺血時MFN2的表達升高，為了明確MORN4是否通過MFN2調節(jié)自噬，首先檢測了MORN4對MFN2的影響，結果表明干擾MORN4抑制，而過表達MORN4促進MFN2的表達。Co

14、-IP結果顯示MORN4可以與MFN2直接結合。Western blot結果表明，SPC可以逆轉MORN4敲減導致的MFN2的降低。因此，SPC可能通過MORN4與mitofusion2(MFN2)的相互作用促進自噬。
　　1.8 SPC通過JNK促進MORN4表達，而MORN4負反饋調節(jié)JNK。
　　SPC可通過JNK調節(jié)自噬，我們探究了JNK與MORN4之間的關系。免疫熒光結果顯示JNK磷酸化的抑制劑SP600125降低

15、MORN4的表達，而western結果表明干擾MORN4后磷酸化的JNK升高。因此SPC通過磷酸化JNK促進MORN4的表達，而MORN4對JNK有負反饋調節(jié)。
　　2.NR4A2通過促進自噬抑制缺血心肌細胞的凋亡
　　2.1.NR4A2在缺血心肌細胞中的表達升高
　　我們利用QPCR，western blot及免疫熒光檢測了NR4A2在缺血心肌細胞中的變化，發(fā)現(xiàn)NR4A2在去除血清的H9c2細胞中，mRNA水平和蛋白

16、水平都有明顯升高。
　　2.2.NR4A2抑制缺血H9c2細胞和原代心肌細胞的凋亡
　　為了探究NR4A2在缺血引發(fā)的心肌細胞凋亡中的作用，我們使用了NR4A2干擾RNA和NR4A2過表達質粒，并利用QPCR及western blot對效果進行了驗證。NR4A2敲減后，PARP和caspase3的切割明顯高于對照組， TUNEL染色發(fā)現(xiàn)NR4A2敲減后，凋亡細胞明顯增多;而過表達NR4A2能夠減少缺血心肌細胞PARP和cas

17、pase3的切割。因此，NR4A2抑制缺血心肌細胞的凋亡。
　　2.3.干擾NR4A2抑制心肌細胞的自噬流
　　為了明確NR4A2是否影響心肌細胞的自噬，我們利用NR4A2的siRNA抑制NR4A2的表達，western blot結果顯示NR4A2敲減能上調LC3-Ⅱ水平;轉入pEGFP-LC3之后，免疫熒光結果表明NR4A2敲減使LC3點狀聚集增加，NR4A2過表達則使LC3-Ⅱ明顯降低。我們進一步利用自噬流的阻斷劑Baf

18、 A1和NH4Cl以及自噬起始的抑制劑3MA驗證NR4A2的作用，western blot結果表明NR4A2敲減抑制了缺血心肌細胞的自噬流。
　　2.4.干擾NR4A2通過抑制自噬流促進缺血H9c2細胞的凋亡
　　為了明確NR4A2調節(jié)的自噬與凋亡是否相關，我們使用了自噬的抑制劑BafA1，western blot顯示PARP和caspase3切割沒有進一步升高;而自噬促進劑Rapamycin加入后心肌細胞的PARP和cas

19、pase3切割明顯被抑制。因此，干擾NR4A2通過阻斷自噬流促進心肌細胞的凋亡。
　　2.5.NR4A2通過p53/Bax抑制H9c2心肌細胞凋亡。
　　為了檢測NR4A2在H9c2心肌細胞中是否通過p53/Bax抑制心肌細胞凋亡，我們將NR4A2進行干擾或過表達，western blot結果表明NR4A2敲減后p53和Bax的表達都升高，而NR4A2過表達后，p53和Bax的表達都降低。co-IP結果顯示p53能與NR4A

20、2相結合，表明NR4A2通過p53/Bax抑制心肌細胞凋亡。免疫熒光結果表明NR4A2抑制了p53在細胞核的定位，由于p53在細胞核中促進細胞自噬，表明NR4A2可能也通過p53調節(jié)自噬。
　　2.6.MiR-212-3p是NR4A2/p53/Bax的上游因子
　　QPCR結果表明miR-212-3p在缺血時表達降低，而且軟件預測發(fā)現(xiàn)MiR-212-3p能夠靶向NR4A2，因此MiR-212-3p可能是靶向NR4A2的上游因

21、子。QPCR和western blot結果表明，MiR-212-3p的inhibitor上調NR4A2 RNA和蛋白水平的表達，而mimics則抑制其表達，表明miR-212-3p能夠調節(jié)NR4A2;雙熒光素報告基因實驗進一步驗證miR-212-3p直接靶向NR4A2。而且，MiR-212-3p的inhibitor抑制缺血心肌細胞凋亡，抑制p53和Bax的水平，與NR4A2的作用一致。因此，miR-212-3p是NR4A2/p53/Ba