內(nèi)皮唾液酸蛋白-TEM-1-CD248單克隆抗體制備及應(yīng)用初探.pdf

1、內(nèi)皮唾液酸蛋白(Endosialin)，又稱為CD248或腫瘤內(nèi)皮標(biāo)志物1(Tumorendothelial marker1，TEM-1)，是基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的一種細(xì)胞表面糖蛋白。在胚胎發(fā)育中高表達(dá)，伴隨個(gè)體出生表達(dá)量逐漸降低，在健康成年個(gè)體中除腎臟、子宮內(nèi)膜外基本不表達(dá)。CD248在1992年被發(fā)現(xiàn)，隨后研究發(fā)現(xiàn)CD248在腫瘤患者基質(zhì)纖維細(xì)胞和周細(xì)胞上表達(dá)增高，其表達(dá)與腫瘤的預(yù)后和進(jìn)展相關(guān)。敲除CD248基因后小鼠能夠正常生長(zhǎng)發(fā)育，但是

2、在成瘤實(shí)驗(yàn)中成瘤體積明顯減小、腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移能力降低。最近研究發(fā)現(xiàn)，除腫瘤外，CD248與臟器的纖維化發(fā)生發(fā)展也密切相關(guān)。人類腎/肝/肺纖維化臨床標(biāo)本中CD248表達(dá)水平與組織纖維化程度呈正相關(guān)。在小鼠模型中，敲除CD248基因可顯著抑制纖維化發(fā)生?；贑D248在腫瘤、纖維化等慢性炎癥性疾病中的重要作用，CD248的研究越來越受到重視。
　　目的:
　　本研究擬通過雜交瘤技術(shù)篩選CD248特異性單克隆抗體，對(duì)篩選到的特異性抗

3、體在腫瘤、纖維化樣本臨床檢測(cè)應(yīng)用進(jìn)行評(píng)估，為探索以CD248為靶標(biāo)的腫瘤及纖維化疾病的診療研究奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.采用原核系統(tǒng)表達(dá)CD248重組蛋白。
　　2.通過雜交瘤技術(shù)篩選抗CD248特異性單克隆抗體。
　　3.構(gòu)建雙抗體夾心捕獲CD248抗原ELISA檢測(cè)方法。
　　4.采用雙抗體夾心ELISA、Western blotting檢測(cè)腫瘤及腎纖維化患者血清、尿液中CD248表達(dá)情況。

4、>　　5.采用免疫組化法(IHC)檢測(cè)單側(cè)輸尿管結(jié)扎(UUO)小鼠腎纖維化模型及臨床纖維化腎臟CD248表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1.通過原核系統(tǒng)表達(dá)、純化后獲得CD248重組蛋白。
　　2.篩選出9株抗CD248單克隆抗體;抗體親和常數(shù)介于1.2×1010 L/mol-8.7×1010L/mol; Western blotting分析9株單抗均可與重組CD248、骨肉瘤SJSA-1細(xì)胞膜蛋白CD248反應(yīng);流式細(xì)胞

5、術(shù)檢測(cè)單抗均可與骨肉瘤SJSA-1細(xì)胞結(jié)合;競(jìng)爭(zhēng)抑制實(shí)驗(yàn)分析9株單抗至少識(shí)別3個(gè)完全不相關(guān)表位;經(jīng)HRP標(biāo)記后可以獲得效價(jià)1∶3200～1∶102400標(biāo)記單抗。
　　3.建立以單抗CD248-M7作為捕獲抗體，CD248-M41-HRP作為檢測(cè)抗體的雙抗體夾心ELISA法。該法檢測(cè)MBP-CD248靈敏度為9.77 ng/mL。
　　4.采用構(gòu)建的ELISA法、Western blotting分析健康人血清中CD248含量

6、與腫瘤患者、腎纖維化患者并無明顯差異。
　　5.采用IHC分析UUO小鼠腎纖維化模型及臨床腎纖維化腎臟組織發(fā)現(xiàn)CD248表達(dá)水平與纖維化程度密切相關(guān)。
　　6.Western blotting分析113例蛋白尿液標(biāo)本表達(dá)CD248情況:急性非腎臟病組陽性率13.3％;慢性腎臟病(CKD)患者組檢測(cè)陽性率在45％以上，其中CKD-5患者陽性率65％。檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行x2檢驗(yàn)，各組檢測(cè)結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(x2=97.07，v=5，p

7、＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.通過雜交瘤技術(shù)，成功應(yīng)用基因工程方法獲得的CD248重組蛋白，以此作為主要免疫原篩選出抗CD248特異性單克隆抗體。
　　2.篩選的抗CD248單抗可以通過ELISA、免疫印跡、免疫組化的方法對(duì)腫瘤、纖維化各種標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè)。
　　3.腫瘤患者、腎纖維化患者血清中CD248含量采用目前構(gòu)建方法檢測(cè)無明顯變化。
　　4.CD248單抗可作為臨床檢測(cè)分析腎纖維化工具。