人血清水溶性維生素B1、B2、B6和B9電化學(xué)法與HPLc-MS-MS法測(cè)定及相關(guān)性研究.pdf

1、目的:1.建立測(cè)定人血清中水溶性維生素B1、B2、B6和B9的高效液相色譜-質(zhì)譜順譜聯(lián)用法并驗(yàn)證。
　　2.比較高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜聯(lián)用法和電化學(xué)分析法用于臨床常規(guī)測(cè)定患者血清中維生素濃度結(jié)果的相關(guān)性與一致性。
　　方法:1.齊魯醫(yī)院常規(guī)送檢患者血清經(jīng)乙酸乙酯萃取。色譜條件;Venusil XBP-C18色譜柱(150×4.6 mm，3μm，100 A)。柱溫30℃，流動(dòng)相5mmol/L乙酸銨水溶液-甲醇(40∶60，v

2、/v)，流速0.5 mL/min。質(zhì)譜條件:ESI離子源，正離子模式檢測(cè);干燥氣溫度為350℃，干燥氣(N2)流速9.0 L/min，干燥氣壓力40 psi，毛細(xì)管電壓4000 V，全掃描設(shè)定范圍為m/z150-700。維生素B1、B2、 B6、 B9和內(nèi)標(biāo)碎片電壓分別為100V、140V、100V、110V和130V，碰撞能分別為8eV、25 eV、11 eV、10 eV和25 eV。掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)。維生素B1、B2、

3、B6、 B9和內(nèi)標(biāo)用于定量的母離子-子離子對(duì)分別為m/z265→122.1、377→244、170→152、442.2→295.8、195.1→137.8。EMV為200V。采用液液萃取法萃取出血清中的維生素后，進(jìn)行方法學(xué)的考察與驗(yàn)證。采用所建立方法，測(cè)定患者常規(guī)送檢血清樣本。
　　2.電化學(xué)分析法:同一患者血清樣本，按照規(guī)定程序操作，采用LK3000V維生素檢測(cè)儀測(cè)定人血清維生素B1、B2, B6和B9的濃度。取適量的患者待測(cè)血

4、清加入到樣本處理液中，電極經(jīng)過(guò)預(yù)處理后進(jìn)行檢測(cè)。維生素B9的檢測(cè)需要電極處理后再按電極活化步驟進(jìn)行電極活化。
　　3.患者血清樣本分別用高效液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)法和電化學(xué)分析法（LK3000V維生素檢測(cè)儀）測(cè)定，測(cè)定結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS19軟件和MedCalc16.2.0軟件。以HPLC-MS/MS法測(cè)定值作為自變量X，以電化學(xué)分析法（LK3000V維生素檢測(cè)儀）測(cè)定值作為因變量Y，建立

5、一元線性回歸模型并評(píng)價(jià)相關(guān)性。運(yùn)用Bland-Altman法并制圖分析兩種方法所測(cè)維生素B1、B2, B6和B9值的一致性。
　　結(jié)果:1.維生素B1、B2、B6、B9線性范圍分別為1-200 ng/mL、5-40 ng/mL、1-80ng/mL和5-40 ng/mL;r2值分別為0.9916、0.9968、0.9922和0.9914;最低定量限分別為1 ng/mL、5 ng/mL、1 ng/mL，5 ng/mL;批內(nèi)、批間RSD

6、均小于8.5％。維生素B1、B2, B6、B9,咖啡因（內(nèi)標(biāo)）基質(zhì)效應(yīng)分別71.82％、69.94％、70.91％、61.20％、81.42％;絕對(duì)回收率分別29.01％、69.39％、63.22％、26.21％、63.79％。配制低、中，高濃度維生素B1、B2、B6和B9血清樣本，室溫放置6h、-20℃冷凍放置1天和7天及凍融1次和處理后血清樣本室溫放置20h，準(zhǔn)確度為89.8％-107.7％，RSD小于10％。結(jié)果表明，維生素B1、

7、B2、B6和B9穩(wěn)定性良好。
　　2.運(yùn)用電化學(xué)法測(cè)定160份患者血清中維生素B1、B2、B6和B9的濃度結(jié)果。電化學(xué)法測(cè)得維生素B1、B2、B6和B9血清濃度均值分別21.44±5.26、6.50±0.80、12.36±3.54,5.59±1.49。
　　3.采用統(tǒng)計(jì)軟件處理HPLC-MS/MS法與電化學(xué)法測(cè)定數(shù)據(jù)。建立一元線性回歸模型可得:B1∶y=1.145x-2.741，n=160，決定系數(shù)r2=0.965;B2∶y

8、=0.923x+1.091，n=160，決定系數(shù)r2=0.956;B6∶y=1.006x+0.391，n=160，決定系數(shù)r2=0.901;B9∶y=1.084x-2.241，n=160，決定系數(shù)r2=0.978.由計(jì)算結(jié)果可見(jiàn)，HPLC-MS/MS法測(cè)定值與電化學(xué)分析法測(cè)定值呈正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)程度較高。運(yùn)用Bland-Altman法并制圖分析兩種測(cè)定方法一致性，維生素B1、B2, B6和B9的95％一致性界限分別為-2.00～2.70

9、，-0.29～1.00，-1.70～2.60，-2.12～-1.15 ng/mL。結(jié)果表明HPLC-MS/MS法與電化學(xué)法測(cè)定人血清維生素B1、B2, B6和B9的測(cè)定值具有較好的一致性。
　　結(jié)論:1.所建立的HPLC-MS/MS法靈敏度高，方法準(zhǔn)確，結(jié)果可靠，可用于常規(guī)送檢患者血清水溶性維生素B1、B2、B6和B9測(cè)定。
　　2.電化學(xué)法測(cè)定人血清中水溶性維生素B1、B2、B6和B9，具有方便快捷，簡(jiǎn)便易操作，靈敏度高等