川陳皮素調(diào)節(jié)大鼠血壓的功能性研究及分子機(jī)制.pdf

1、本研究以柑橘多甲氧基黃酮提取物中的主要活性成分之一川陳皮素為研究主體，分別在SD大鼠體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)中，探索了川陳皮素的血管舒張效應(yīng)，并且深入探討了川陳皮素引起血管舒張效應(yīng)的具體分子機(jī)制及相關(guān)舒張、收縮因子的變化，為進(jìn)一步開發(fā)利用柑橘多甲氧基黃酮提取物及其活性成分川陳皮素作為功能食品或藥品的使用提供理論依據(jù)。
　　SD大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，首先選取200-250g雄性SD大鼠，腹腔注射15mg/kg/d NG-硝基-左旋精氨酸（L-NNA）

2、28d，制作內(nèi)皮損傷型高血壓大鼠模型，分成6組，即正常對照組（生理鹽水組），造模組（L-NNA模型組），劑量組:L-NNA+川陳皮素低劑量組（1.8mg/kg/d），L-NNA+川陳皮素中劑量組(3.6mg/kg/d)，L-NNA+川陳皮素高劑量組(7.2mg/kg/d)和陽性對照組（替米沙坦組80mg/Kg/d），每組設(shè)5只平行大鼠。灌胃共計(jì)28d，檢測以下指標(biāo)變化:（一）分別于14d和28d時(shí)通過尾套法測量大鼠尾動脈血壓及心率變化和

3、天平稱量大鼠體重變化;（二）于28d后，采集各實(shí)驗(yàn)組大鼠的動脈血，酶聯(lián)免疫試劑盒測定四種與血管收縮舒張有關(guān)的活性因子（PGI2，ANG2，EDHF和總NO）的含量;（三）于28d后，采集各實(shí)驗(yàn)組大鼠胸主動脈、心臟組織和腎臟組織，經(jīng)HE染色后，觀察組織結(jié)構(gòu)變化。研究結(jié)果表明:（一）SD大鼠L-NNA腹腔注射28d后，與生理鹽水組相比，血壓明顯升高，≥140mmHg，且血壓上升20mmHg，表示高血壓大鼠模型造模成功。（二）陽性對照藥替米沙

4、坦組造模后與造模前相比，血壓顯著升高，為178±9.08mmHg，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05，給藥14d后與造模后相比，血壓顯著降低為123±1.56mmHg，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05，給藥14d后與給藥28天后相比，血壓降低無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;川陳皮素低劑量組造模后與造模前相比，血壓顯著升高，為184±29.46 mmHg，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05，確認(rèn)造模成功，給藥14d后與造模后相比，血壓顯著降低，為127±11.59 mmH

5、g，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05，給藥28d后與給藥14天后相比，血壓降低無明顯變化，為135±13.23mmHg，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。川陳皮素中劑量組造模后與造模前相比，血壓顯著升高，為196±34.02mmHg，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05，確認(rèn)造模成功，給藥14d后與造模后相比，血壓顯著降低，為124±9.00 mmHg，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05，給藥28d后與給藥14d天后相比，血壓降低無明顯變化，為127±9.64mmHg，無統(tǒng)

6、計(jì)學(xué)意義。川陳皮素高劑量組造模后與造模前相比，血壓顯著升高，為175±5.51mmHg，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05，確認(rèn)造模成功，給藥14d后與造模后相比，血壓顯著降低，為137±7.21 mmHg，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05，給藥28d后與給藥14天后相比，血壓降低無明顯變化，為142±10.50mmHg，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但各劑量組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且與陽性對照組相比，也無明顯差異，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。并且各組間大鼠體重及心率無明顯變化，無

7、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;此結(jié)果說明在高血壓大鼠模型中，川陳皮素可顯著降低大鼠血壓;（三）酶聯(lián)免疫試劑盒檢測結(jié)果顯示:
　　①PGI2含量的變化:川陳皮素低劑量組與造模組比較，川陳皮素對實(shí)驗(yàn)大鼠動脈血中的PGI2含量的變化的影響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;川陳皮素中劑量組與低劑量組和造模組，正常組相比，PGI2含量顯著升高，為79.0±6.3 ng/L，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05;川陳皮素高劑量組與中劑量組相比，川陳皮素對實(shí)驗(yàn)大鼠動脈血中的PGI2含量的影

8、響無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而與低劑量組和造模組，正常組相比，PGI2含量顯著升高，為89.8±4.0 ng/L，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05;
　?、贏NG2含量的變化:川陳皮素低，中，高三個(gè)劑量組在處理前后，實(shí)驗(yàn)大鼠動脈血中的ANG2含量均沒有明顯升高或降低，與正常對照組，造模組及陽性對照組相比，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;
　　③EDHF含量的變化:川陳皮素低，中，高三個(gè)劑量組在處理前后，實(shí)驗(yàn)大鼠動脈血中的EDHF含量均沒有明顯升高或降低，與正

9、常對照組，造模組及陽性對照組相比，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;
　?、芸侼O含量的變化:川陳皮素低劑量組與造模組和正常組相比，川陳皮素可顯著增高實(shí)驗(yàn)大鼠動脈血中的總NO含量，為91.3±3.9 ng/L，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05;川陳皮素中劑量組與造模組和正常組相比，總NO含量顯著升高，為89.0±6.3 ng/L，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05;川陳皮素高劑量組與造模組和正常組相比，川陳皮素顯著增加實(shí)驗(yàn)大鼠動脈血中的總NO含量，為90.8±

10、4.0 ng/L，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05，但各劑量組間，總NO含量無明顯差異，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且與陽性對照組相比，也無明顯差異，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此結(jié)果說明在高血壓模型大鼠中，川陳皮素介導(dǎo)的大鼠的抗高血壓效應(yīng)與血漿中的PGI2和總NO含量有關(guān)，而與ANG2和EDHF含量無關(guān);（四）HE染色后，顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)各實(shí)驗(yàn)組間，大鼠胸主動脈，心臟組織和腎臟組織的結(jié)構(gòu)均無明顯病理改變。
　　大鼠體外實(shí)驗(yàn)中，選取200-250g雄性SD大鼠

11、，分離腸系膜動脈和肺動脈，（一）給予基礎(chǔ)張力后，10-6M苯腎上腺素（phenylephrine，PE）預(yù)收縮，加入10-9-10-5M的川陳皮素，采用血管環(huán)組織浴槽測定血管張力的變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明10-5M川陳皮素可明顯誘導(dǎo)大鼠離體腸系膜動脈舒張，舒張率為36.87±3.57％，且呈濃度依賴性，EC50值為16.34±5.61μM，而對離體肺動脈無舒張效應(yīng);（二）在去除內(nèi)皮層的大鼠離體腸系膜動脈血管環(huán)中，10-6M PE預(yù)收縮后，加入

12、10-9-10-5M的川陳皮素，觀察血管張力的變化，發(fā)現(xiàn)川陳皮素介導(dǎo)的大鼠離體腸系膜動脈的血管舒張效應(yīng)幾乎消失，說明川陳皮素引起的大鼠離體腸系膜動脈的舒張呈內(nèi)皮依賴性;（三）在內(nèi)皮完整的大鼠離體腸系膜動脈血管環(huán)中，一氧化氮合酶(eNOS)抑制劑ι-NAME(10-4M)孵育30min，10-6M PE預(yù)收縮后，加入10-9-10-5M的川陳皮素，發(fā)現(xiàn)川陳皮素介導(dǎo)的大鼠離體腸系膜動脈血管舒張率明顯下降，為21.90±2.06％，說明川陳皮

13、素引起的大鼠離體腸系膜動脈的舒張效應(yīng)與血管內(nèi)皮細(xì)胞的eNOS部分相關(guān);（四）在培養(yǎng)的大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞中，加入10-5M川陳皮素后，提取細(xì)胞蛋白，檢測川陳皮素對總eNOS蛋白的表達(dá)和磷酸化eNOS活力的影響，結(jié)果表明與對照組相比，10-5M川陳皮素可明顯增強(qiáng)p-eNOS-1177的活性，但不影響總eNOS蛋白的表達(dá)，而eNOS的抑制劑ι-NAME可抑制磷酸化eNOS的活性，說明川陳皮素通過增加p-eNOS-1177的活力來介導(dǎo)血管舒張;

14、（五）在培養(yǎng)的大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞中，加入10-5M川陳皮素后，熒光探針檢測了NO產(chǎn)物的含量，結(jié)果表明川陳皮素可明顯增加大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞中NO產(chǎn)物的含量，而加入eNOS的抑制劑ι-NAME后，川陳皮素介導(dǎo)NO產(chǎn)物增加的效應(yīng)被抑制，此結(jié)果說明川陳皮素通過激活p-eNOS-1177，增加NO產(chǎn)物含量，介導(dǎo)血管舒張;（六）在內(nèi)皮完整的大鼠離體腸系膜動脈血管環(huán)中，分別孵育PI3K/AKT抑制劑Wortmannin，PKA抑制劑H-89，SIRT

15、1的抑制劑Nicotinamide和RORs的抑制劑SR100130min，PE預(yù)收縮后，加入10-9-10-5M的川陳皮素，觀察血管張力的變化，結(jié)果表明川陳皮素介導(dǎo)的大鼠離體腸系膜動脈的血管舒張效應(yīng)無明顯變化，說明川陳皮素舒張大鼠離體腸系膜動脈與PI3K/AKT，PKA，SIRT1和RORs信號通路無關(guān);（七）在內(nèi)皮完整的大鼠離體腸系膜動脈血管環(huán)中，應(yīng)用無鈣液替換有鈣液后，加入10-9-10-5M的川陳皮素，觀察血管張力的變化，結(jié)果表

16、明川陳皮素介導(dǎo)的大鼠離體腸系膜動脈的血管舒張率顯著變小，為12.83±2.22％，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，此結(jié)果說明血管內(nèi)皮細(xì)胞中的Ca2+參與了川陳皮素介導(dǎo)的大鼠離體腸系膜動脈的血管舒張效應(yīng);（八）在培養(yǎng)的大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞中，加入10-5M川陳皮素后，觀察內(nèi)皮細(xì)胞中Ca2+濃度的變化，結(jié)果表明與正常對照組相比，川陳皮素可顯著增加大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞中的Ca2+含量，為1.24±0.13，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，此結(jié)果說明川陳皮素可顯著提高大鼠主動脈內(nèi)皮

17、細(xì)胞中的Ca2+濃度，高濃度的Ca2+可激活內(nèi)皮細(xì)胞的磷酸化eNOS，促進(jìn)NO產(chǎn)生，發(fā)揮血管舒張效應(yīng);（九）在培養(yǎng)的大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞中，孵育Ca2+釋放通道IP3受體的拮抗劑2-APB30min，加入10-5M川陳皮素后，觀察川陳皮素對內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度影響的變化，結(jié)果表明在抑制細(xì)胞內(nèi)鈣釋放后，川陳皮素介導(dǎo)的大鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞中的Ca2+含量增加的效應(yīng)明顯被抑制，為0.93±0.008，與正常對照組相比，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.0