TGF-β1介導(dǎo)TGF-β1-Smad及ERK-MAPK通路協(xié)同促進大鼠骨髓炎瘢痕形成的機制研究.pdf

1、第一章大鼠骨髓炎動物模型建立和評估的研究
　　研究背景
　　骨髓炎是是致病微生物感染骨及周圍組織并引起骨破壞的急慢性炎性反應(yīng)過程，按照感染來源可以分類為血源性骨髓炎、創(chuàng)傷性骨髓炎和臨近組織感染性骨髓炎。創(chuàng)傷性骨髓炎是由外傷、手術(shù)等因素引起的骨感染，臨床上治療極為棘手，它的病理特點表現(xiàn)為病原菌持續(xù)存在、炎癥反復(fù)刺激、周圍組織瘢痕以及死骨形成，常常發(fā)展為慢性骨髓炎。由于其治療時間長、治療效果差，病程遷延不愈，有些病人最終面臨截肢

2、的后果，給病人和社會帶來繁重的負擔。臨床上創(chuàng)傷性骨髓炎的病理生理過程復(fù)雜多變，因而建立一種穩(wěn)定的創(chuàng)傷性骨髓炎動物模型，對理解骨髓炎的發(fā)生、發(fā)展過程并指導(dǎo)臨床骨髓炎的預(yù)防及治療，有著重要的意義。
　　多種動物可用于制作骨髓炎模型，大型動物具有耐受性好等優(yōu)點，但是花費高，小型動物利于操作、花費低，但是耐受性差。應(yīng)根據(jù)不同的實驗?zāi)康倪x擇不同的實驗動物。骨髓炎動物模型的制作方法也不盡相同，有局部細菌注射、局部硬化劑注射、異物植入等方法，目

3、前沒有統(tǒng)一的骨髓炎動物模型制作標準。
　　研究目的
　　在文獻及前期研究基礎(chǔ)上，建立一種穩(wěn)定的、能夠模擬臨床中創(chuàng)傷性骨髓炎發(fā)生機制的骨髓炎動物模型，并建立骨髓炎相關(guān)指標評價體系，為后續(xù)實驗做準備。
　　研究方法
　　30只wistar大鼠分為兩組，A組為空白對照組，B組為骨髓炎模型組。每組15只實驗動物，分別于7，14，28天取材。根據(jù)取材時間A、B兩組各分為3個亞組。其中A組實驗動物切開皮膚肌肉顯露一側(cè)股骨后直

4、接縫合，B組為骨髓炎模型組，動物模型制作具體操作如下:大鼠腹腔注射水合氯醛溶液腹腔麻醉生效后，下肢常規(guī)剃毛后固定四肢于木板，術(shù)區(qū)消毒、鋪洞巾，采用股骨外側(cè)入路，縱向切開皮膚、肌肉，顯露一側(cè)股骨中段，利用咬骨鉗在股骨中段咬成小蝶形骨塊，造成股骨干骨折，自股骨大轉(zhuǎn)子順骨髓腔鉆入直徑為1.0cm的克氏針固定股骨，將50ul濃度為106CFU/ml的金黃色葡萄球菌懸液注射于骨折斷端，表面覆蓋明膠海綿減少細菌懸液溢出，將游離蝶形骨折塊回植，逐層縫

5、合切口。術(shù)后觀察兩組實驗動物7，14，28天的切口愈合情況;于術(shù)后7，14，28天分別拍攝股骨X線，觀察骨折端軟組織腫脹程度、骨膜反應(yīng)及骨質(zhì)改變;術(shù)后7，14，28天分別留取肌肉組織及骨骼組織標本，利用HE染色方法觀察肌肉組織及骨骼組織細微結(jié)構(gòu)的變化，利用細菌學方法培養(yǎng)骨骼組織觀察細菌感染情況，培養(yǎng)出金黃色葡萄球菌為模型制作成功標準。
　　研究結(jié)果
　　對照組術(shù)后手術(shù)部位愈合良好，未見切口感染表現(xiàn);骨髓炎組實驗動物術(shù)后7天出

6、現(xiàn)手術(shù)部位腫脹，術(shù)后14天手術(shù)部位少量膿液溢出，術(shù)后28天手術(shù)部位大量膿液、死骨排出。對照組術(shù)后X線骨質(zhì)正常;骨髓炎組術(shù)后X線7天可見輕度骨膜反應(yīng)，術(shù)后14天可見骨膜反應(yīng)加重，部分骨痂形成，骨皮質(zhì)變薄，髓腔變寬，術(shù)后28天可見感染征象，骨質(zhì)破壞，呈蟲蝕樣改變，硬化骨形成，失去正常髓腔結(jié)構(gòu)。對照組軟組織HE染色未見感染及肉芽組織增生征象;骨髓炎組術(shù)后7天肌肉軟組織HE染色見骨骼肌細胞壞死，大量中性粒細胞及單核細胞浸潤，術(shù)后14天骨骼肌細胞

7、稀疏、大量毛細血管增生，組織內(nèi)成纖維細胞增生，術(shù)后28天組織內(nèi)旋渦狀肉芽組織增生，瘢痕形成表現(xiàn)。對照組術(shù)后骨質(zhì)HE染色呈正常形態(tài)，骨皮質(zhì)完整有序;骨髓炎組骨骼HE染色在術(shù)后7天可見骨皮質(zhì)內(nèi)炎細胞浸潤，術(shù)后14天見骨皮質(zhì)內(nèi)骨質(zhì)吸收，髓腔擴大，術(shù)后28天見炎細胞減少，骨質(zhì)稀疏，骨皮質(zhì)破壞較重。對照組骨骼組織細菌培養(yǎng)陰性，骨髓炎組術(shù)后7、14、28均培養(yǎng)出金黃色葡萄球菌。
　　研究結(jié)論
　　通過我們改良的方法，能模擬臨床創(chuàng)傷性骨髓

8、炎發(fā)生過程，制作出穩(wěn)定的骨髓炎動物模型，為后續(xù)實驗提供保障。
　　第二章 TGF-β1/Smad及ERK/MAPK信號通路的表達變化與大鼠骨髓炎周圍軟組織瘢痕形成之間的關(guān)系
　　研究背景
　　骨髓炎具有遷延不愈的特點，慢性炎癥刺激可逐步影響到周圍軟組織，導(dǎo)致軟組織瘢痕形成。一方面，骨髓炎周圍軟組織瘢痕的形成不利于血液循環(huán)微環(huán)境的建立，影響抗菌藥物到達病灶發(fā)揮抗炎作用;另一方面，骨髓炎周圍軟組織瘢痕對肢體美觀及功能也有影

9、響。骨髓炎的治療宜采用抗生素藥物治療與手術(shù)清除壞死感染組織相結(jié)合的方法，無論是手術(shù)治療還是抗菌藥物治療，減輕局部瘢痕形成從而建立一個有血運的微環(huán)境對骨髓炎的治療至關(guān)重要。TGF-β1是引起纖維化疾病的重要細胞因子之一，其介導(dǎo)的經(jīng)典的TGF-β1/Smad信號通路以及非經(jīng)典的ERK/MAPK信號通路在纖維化疾病形成中起重要作用，然而骨髓炎中瘢痕化機制是否與TGF-β1介導(dǎo)的TGF-β1/Smad及ERK/MAPK信號通路有關(guān)還未被闡明，研

10、究骨髓炎中瘢痕形成機制對臨床上骨髓炎的預(yù)防、治療有重要意義。
　　研究目的
　　1.研究骨髓炎動物模型中軟組織瘢痕形成的時間。
　　2.研究TGF-β1介導(dǎo)的TGF-β1/Smad信號通路以及ERK/MAPK信號通路的表達變化，與骨髓炎周圍軟組織瘢痕形成之間的關(guān)系。
　　研究方法
　　30只wistar大鼠分為兩組，A組為空白對照組，B組為骨髓炎模型組。每組15只實驗動物，分別于7，14，28天取材。根據(jù)取

11、材時問A、B兩組各分為A1-3以及B1-3個亞組。根據(jù)第一章模型制作方法，利用金黃色葡萄球菌制作大鼠骨髓炎動物模型。免疫組織化學染色檢測軟組織中TGF-β1表達變化，MASSON染色檢測膠原沉積程度，Western blot檢測TGF-β1/Smad信號通路、ERK/MAPK信號通路以及Ⅰ型膠原的表達變化。
　　研究結(jié)果
　　TGF-β1免疫組織化學染色顯示，對照組中在1周、2周、4周時TGF-β1陽性表達分數(shù)分別為11.0

12、8％、13.86％、13.62％，骨髓炎組TGF-β1陽性表達分數(shù)在1周、2周、4周時分別為19.07％、56.35％、83.12％，骨髓炎組與對照組相比，1周時TGF-β1表達無顯著性差異(P＞0.05)，2周及4周時TGF-β1表達水平增高，有顯著性差異(P＜0.05); MASSON染色顯示，對照組中在1周、2周、4周時膠原容積分數(shù)分別為0.19％、0.11％、0.85％，骨髓炎組膠原容積分數(shù)在1周、2周、4周時分別為1.37％、

13、43.72％、83.59％，骨髓炎組與對照組相比，1周時膠原容積分數(shù)無顯著性差異(P＞0.05)，2周及4周時膠原容積分數(shù)有顯著性差異(P＜0.05);Western blot顯示，對照組中在1周、2周、4周時TGF-β1/GAPDH灰度值比值分別為35.80％、34.86％、33.94％，骨髓炎組中在1周、2周、4周時TGF-β1/GAPDH灰度值比值分別為34.47％、80.52％、225.95％。骨髓炎組與對照組相比，1周時TGF

14、-β1表達無顯著性差異(P＞0.05)，2周及4周時TGF-β1表達水平增高，有顯著性差異(P＜0.05);對照組中在1周、2周、4周時pSmad2/Smad2/3灰度值比值分別為8.10％、8.61％、8.93％，骨髓炎組中在1周、2周、4周時pSmad2/Smad2/3灰度值比值分別為8.34％、17.61％、33.71％。骨髓炎組與對照組相比，1周時pSmad2表達無顯著性差異(P＞0.05)，2周及4周時pSmad2表達水平增高

15、，有顯著性差異(P＜0.05);對照組中在1周、2周、4周時pSmad3/Smad2/3灰度值比值分別為7.45％、6.35％、7.69％，骨髓炎組中在1周、2周、4周時pSmad3/Smad2/3灰度值比值分別為7.39％、15.54％、51.95％。骨髓炎組與對照組相比，1周時pSmad3表達無顯著性差異(P＞0.05)，2周及4周時pSmad3表達水平增高，有顯著性差異(P＜0.05);對照組中在1周、2周、4周時pERK1/2/

16、ERK1/2灰度值比值分別為15.33％、13.86％、9.51％，骨髓炎組中在1周、2周、4周時pERK1/2/ERK1/2灰度值比值分別為16.37％、51.29％、49.30％。骨髓炎組與對照組相比，1周時pERK1/2表達無顯著性差異(P＞0.05)，2周及4周時pERK1/2表達水平增高，有顯著性差異(P＜0.05);對照組中在1周、2周、4周時CollagenⅠ/GAPDH灰度值比值分別為39.48％、33.51％、31.6

17、9％，骨髓炎組中在1周、2周、4周時CollagenⅠ/GAPDH灰度值比值分別為43.90％、15.54％、19.55％。骨髓炎組與對照組相比，1周時Collagen1表達無顯著性差異(P＞0.05)，2周及4周時CollagenⅠ表達水平增高，有顯著性差異(P＜0.05)。
　　研究結(jié)論
　　(1)骨髓炎周圍軟組織瘢痕化在術(shù)后14天出現(xiàn)，至術(shù)后28天瘢痕化程度逐漸增強。
　　(2)骨髓炎動物模型中，TGF-β1/S

18、mad信號通路在術(shù)后14天被活化，至術(shù)后28天活化程度持續(xù)增加。
　　(3)骨髓炎動物模型中，ERK/MAPK信號通路在術(shù)后14天被活化，至術(shù)后28天活化程度持續(xù)增加。
　　(4) TGF-β1/Smad信號通路以及ERK/MAPK信號通路在骨髓炎周圍軟組織膠原沉積、瘢痕形成中起重要作用。提示這兩條通路可作為抑制骨髓炎周圍瘢痕形成的靶點。
　　第三章抑制TGF-β1/Smad及ERK/MAPK信號通路對大鼠骨髓炎軟組織

19、瘢痕形成的影響
　　研究背景
　　TGF-β1能夠調(diào)控細胞的增殖與分化，這一過程主要由TGF-β1/Smad信號通路將細胞外信號傳導(dǎo)至細胞核，調(diào)節(jié)相應(yīng)的效應(yīng)基因?qū)崿F(xiàn)。在經(jīng)典的TGF-β1/Smad信號通路中，TGF-β1首先與細胞膜上的TβRⅠ、Tβ RⅡ受體相結(jié)合，結(jié)合復(fù)合體將細胞漿中Smad2、Smad3活化，從而與Smad4相結(jié)合、轉(zhuǎn)位至細胞核內(nèi)調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄。除經(jīng)典的TGF-β1/Smad細胞信號通路，TGF-β1也

20、介導(dǎo)非Smad依賴的信號通路，如通過激化Ras/Raf/MEK/ERK，最終激活ERK，調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致纖維細胞增殖。除TGF-β1介導(dǎo)兩條單獨的信號通路外，ERK與Smad也存在交叉對話，共同調(diào)節(jié)細胞的功能變化，兩者之間的串話，主要經(jīng)Smad2、Smad3連接區(qū)的磷酸化位點實現(xiàn)。在不同的細胞，ERK與Smad之間的串話，表現(xiàn)出抑制或促進細胞增殖的不同的生物學效應(yīng)。目前，在骨髓炎周圍軟組織瘢痕形成的研究中，阻斷TGF-β1/Smad

21、與ERK/MAPK兩條信號通路能否減輕軟組織瘢痕化，以及ERK與Smad之間的串話對瘢痕形成產(chǎn)生怎樣的影響，仍然未被闡明。
　　研究目的
　　1.在大鼠骨髓炎動物模型中阻斷TGF-β1，研究阻斷其介導(dǎo)的TGF-β1/Smad信號通路及ERK/MAPK信號通路，對骨髓炎周圍軟組織瘢痕形成的影響。
　　2.阻斷ERK1/2，探討ERK1/2與Smad2/3之間的串話，對大鼠骨髓炎周圍軟組織瘢痕形成的影響。
　　研究方

22、法
　　1.20只wistar大鼠分為兩組，A組為Decorin處理組，B組為骨髓炎模型組，每組10只實驗動物。根據(jù)取材時間A、B兩組各分為A1-2以及B1-2個亞組。骨髓炎模型組根據(jù)第一章模型制作方法，利用金黃色葡萄球菌制作大鼠骨髓炎動物模型。Decorin處理組于術(shù)后1，3，5天通過1ml注射器于骨髓炎周圍軟組織內(nèi)肌肉注射Decorin50ug。骨髓炎組于術(shù)后1，3，5天于骨髓炎周圍軟組織內(nèi)肌肉注射PBS0.5ml。分別于術(shù)后

23、第14、28天取材。MASSON染色檢測膠原沉積程度，Westernblot檢測TGF-β1、Smad2/3、 ERK1/2以及Ⅰ型膠原的表達變化。
　　2.20只wistar大鼠分為兩組，A組為PD98059處理組，B組為骨髓炎模型組，每組10只實驗動物。根據(jù)取材時間A、B兩組各分為A1-2以及B1-2個亞組。骨髓炎模型組根據(jù)第一章模型制作方法，利用金黃色葡萄球菌制作大鼠骨髓炎動物模型。PD98059處理組于術(shù)后1，3，5天通過

24、1ml注射器于骨髓炎周圍軟組織內(nèi)肌肉注射PD9805910mg/kg。骨髓炎組于術(shù)后1，3，5天通過1ml注射器于骨髓炎周圍軟組織內(nèi)肌肉注射PBS0.5ml。分別于術(shù)后第14、28天取材。MASSON染色檢測膠原沉積程度，Western blot檢測ERK1/2、Smad2/3以及Ⅰ型膠原的表達變化。
　　研究結(jié)果
　　1.MASSON染色顯示，Decorin處理組在2周、4周時膠原容積分數(shù)分別為15.55％、39.27％，

25、骨髓炎組膠原容積分數(shù)在2周、4周時分別為48.57％、68.22％，Decorin處理組與骨髓炎組相比，2周及4周時膠原容積分數(shù)有顯著性差異(P＜0.05)。Western blot顯示，Decorin處理組在2周、4周時TGF-β1/GAPDH灰度值比值分別為1.16％、3.93％，骨髓炎組在2周、4周時TGF-β1/GAPDH灰度值比值分別為8.57％、15.22％，Decorin處理組與骨髓炎組相比，在2周、4周時TGF-β1表達

26、有顯著性差異(P＜0.05); Decorin處理組在2周、4周時pSmad2/Smad2/3灰度值比值分別為5.26％、4.01％，骨髓炎組在2周、4周時pSmad2/Smad2/3灰度值比值分別為8.60％、11.68％，Decorin處理組與骨髓炎組相比，在2周、4周時pSmad2表達有顯著性差異(P＜0.05);Decorin處理組在2周、4周時pSmad3/Smad2/3灰度值比值分別為1.04％、2.44％，骨髓炎組在2周、

27、4周時pSmad3/Smad2/3灰度值比值分別為9.02％、13.65％，Decorin處理組與骨髓炎組相比，在2周、4周時pSmad3表達有顯著性差異(P＜0.05); Decorin處理組在2周、4周時pERK1/2/ERK1/2灰度值比值分別為17.94％、14.75％，骨髓炎組在2周、4周時pERK1/2/ERK1/2灰度值比值分別為48.99％、53.75％，Decorin處理組與骨髓炎組相比，在2周、4周時pERK1/2表

28、達有顯著性差異(P＜0.05);Decorin處理組在2周、4周時CollagenⅠ/ GAPDH灰度值比值分別為5.94％、4.75％，骨髓炎組在2周、4周時CollagenⅠ/GAPDH灰度值比值分別為15.99％、26.75％，Decorin處理組與骨髓炎組相比，在2周、4周時CollagenⅠ表達有顯著性差異(P＜0.05);
　　2.MASSON染色顯示，PD98059處理組在2周、4周時膠原容積分數(shù)分別為21.13％、

29、39.79％，骨髓炎組膠原容積分數(shù)在2周、4周時分別為41.34％、63.61％，PD98059處理組與骨髓炎組相比，2周及4周時膠原容積分數(shù)有顯著性差異(P＜0.05)。Western blot顯示， PD98059處理組在2周、4周時pERK1/2/ERK1/2灰度值比值分別為9.18％、12.95％，骨髓炎組在2周、4周時pERK1/2/ERK1/2灰度值比值分別為39.99％、46.54％，PD98059處理組與骨髓炎組相比，在

30、2周、4周時pERK1/2表達有顯著性差異(P＜0.05); PD98059處理組在2周、4周時pSmad2/Smad2/3灰度值比值分別為3.24％、9.20％，骨髓炎組在2周、4周時pSmad2/Smad2/3灰度值比值分別為15.31％、21.44％，PD98059處理組與骨髓炎組相比，在2周、4周時pSmad2表達有顯著性差異(P＜0.05); PD98059處理組在2周、4周時pSmad3/Smad2/3灰度值比值分別為0.9

31、6％、2.14％，骨髓炎組在2周、4周時pSmad3/Smad2/3灰度值比值分別為3.02％、12.35％，PD98059處理組與骨髓炎組相比，在2周、4周時pSmad3表達有顯著性差異(P＜0.05); PD98059處理組在2周、4周時CollagenⅠ/GAPDH灰度值比值分別為4.40％、5.15％，骨髓炎組在2周、4周時CollagenⅠ/GAPDH灰度值比值分別為11.69％、18.65％，PD98059處理組與骨髓炎組相