初級聽覺皮層預(yù)測相關(guān)神經(jīng)機(jī)制.pdf

1、及時地對環(huán)境信息做出合適的行為反應(yīng)是動物在進(jìn)化過程中獲得的一項基本能力，其中一個很重要的方面就是動物基于過去新近感覺經(jīng)驗(yàn)，提煉出規(guī)律，進(jìn)而根據(jù)這個規(guī)律來預(yù)測即將到來的感覺信息。這種預(yù)測對動物的認(rèn)知、決策以及行為調(diào)整都有重要的影響。比如，對于那些能穩(wěn)定誘發(fā)動物行為反應(yīng)的感覺信息，在連續(xù)間隔相同時間的一串刺激過后，動物通常會在相應(yīng)的時間點(diǎn)上繼續(xù)之前的行為應(yīng)答。此外，患有精神分裂癥、焦慮癥等精神心理疾病的病人，他們的預(yù)測能力不論在腦活動的表現(xiàn)

2、上，還是神經(jīng)心理的檢測上都表現(xiàn)出不足。然而，對于哪些神經(jīng)環(huán)路和腦區(qū)是編碼預(yù)測信號和產(chǎn)生預(yù)測行為所必須的，幾乎還一概不知。而這些信息也許能揭示出一些他們所患疾病的神經(jīng)病理機(jī)制。雖然對于編碼即時感覺刺激的新皮層神經(jīng)環(huán)路的研究已經(jīng)有許多，但這些環(huán)路在預(yù)測即將到來的感覺信息當(dāng)中的作用卻還知之甚少。因此，用在體雙光子細(xì)胞成像技術(shù)、光纖記錄技術(shù)和光遺傳興奮抑制技術(shù)對小鼠初級聽覺皮層的活動進(jìn)行了記錄和操控，試圖解析其活動在預(yù)測信號和預(yù)測行為產(chǎn)生中所起

3、的作用。
　　目的：
　　1.探測一連串規(guī)律聲音刺激后，初級聽覺皮層的預(yù)測信號及其行為學(xué)表征;
　　2.觀測初級聽覺皮層節(jié)律性聲音預(yù)測信號與小鼠預(yù)測行為之間的因果關(guān)系;
　　3.探索聽覺丘腦在小鼠節(jié)律性聲音預(yù)測行為產(chǎn)生中是否必須。
　　方法：
　　1.初級聽覺皮層雙光子鈣成像
　　使用高敏感度的熒光鈣離子指示劑Cal-520酯類分子來標(biāo)記初級聽覺皮層，使得皮層內(nèi)某一區(qū)域的細(xì)胞群體被標(biāo)記上鈣染料。

4、鈣染料注射后一個小時即可進(jìn)行雙光子成像，且能持續(xù)長達(dá)8個小時。在整個實(shí)驗(yàn)過程中，小鼠的體溫被保持在36.5-37.5℃C。對頭部固定的清醒小鼠進(jìn)行雙光子成像實(shí)驗(yàn)之前，小鼠需要先被訓(xùn)練以適應(yīng)頭部固定的方式，訓(xùn)練時間為3-5天。
　　2.行為學(xué)任務(wù)
　　發(fā)展了一個簡單的聲音與舔水行為相偶聯(lián)的行為學(xué)任務(wù)。在每次聲音刺激（白噪音，76分貝，時長100毫秒）過后100毫秒，實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)都會提供時長為20毫秒的水。小鼠在訓(xùn)練的過程中需要學(xué)會

5、在聲音刺激和水供之間建立聯(lián)系，進(jìn)而能夠在聽到聲音后一段很短的時間內(nèi)進(jìn)行舔水行為。當(dāng)小鼠的這種偶聯(lián)反應(yīng)成功率超過80％，則被視為訓(xùn)練成功，用于實(shí)驗(yàn)。
　　3.光纖與行為學(xué)同步記錄
　　記錄光纖放置在皮層硬腦膜表面，并用牙科水泥固定于顱骨。為了激活熒光染料分子(OGB-1AM)，光纖尖端處會持續(xù)的發(fā)射出微弱激光。并且，被激發(fā)出來的熒光也是被同一根光纖收集，最后通過鈣信號表現(xiàn)出來。同時，小鼠的舔水行為會被紅外相機(jī)(采樣率：30Hz

6、)同步記錄下來。
　　4.光遺傳學(xué)激活和抑制
　　在進(jìn)行光遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)之前，興奮性的轉(zhuǎn)基因動物Thy1-ChR2-YFP或者注射了光遺傳學(xué)相關(guān)的病毒的動物需要先進(jìn)行行為學(xué)訓(xùn)練。實(shí)驗(yàn)時，在麻醉狀態(tài)下，兩根光纖被置于小鼠雙側(cè)聽覺皮層的第5層或者內(nèi)側(cè)膝狀體表面。麻醉過后至少兩小時再開始進(jìn)行小鼠行為學(xué)實(shí)驗(yàn)。光刺激由473納米的藍(lán)光或者593納米的黃光組成，時長100毫秒。每次光刺激過后100毫秒，實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)都會提供時長為20毫秒的水。<

7、br>　　結(jié)果：
　　1.聽皮層神經(jīng)元節(jié)律性聲音預(yù)測信號的檢測
　　1.1在麻醉和清醒狀態(tài)下，聽皮層第2/3層神經(jīng)元節(jié)律性聲音預(yù)測信號的檢測
　　首先用鈣染料Cal-520AM對初級聽覺皮層第2/3層神經(jīng)元進(jìn)行雙光子鈣成像實(shí)驗(yàn)，觀測神經(jīng)元的鈣活動。對單個神經(jīng)元同步的電生理和鈣活動記錄表明，在我們的實(shí)驗(yàn)條件下，鈣染料Cal-520AM能夠以接近100％的成功率反映出神經(jīng)元的單個動作電位發(fā)放。進(jìn)而在一連串規(guī)律白噪音刺激（時

8、長100毫秒，聲強(qiáng)76分貝，刺激間隔2秒）之前，之中和之后都記錄了清醒或麻醉小鼠的初級聽覺皮層第2/3層神經(jīng)元的鈣活動。發(fā)現(xiàn)在最后一次聲音刺激過后，在與之前聲音刺激相應(yīng)的時間間隔點(diǎn)，大約15％（麻醉狀態(tài)）或者21.5％（清醒狀態(tài)）的神經(jīng)元會再活動一到三次，就像仍有聲音刺激一般（實(shí)際沒有）。將此類在期待的時間點(diǎn)產(chǎn)生的活動稱為“回聲響應(yīng)”。將聲音刺激的間隔改為4秒后，仍有部分神經(jīng)元表現(xiàn)出回聲響應(yīng)。與此相反的是，當(dāng)將聲音刺激的時間間隔變得不固

9、定（2秒和3秒交替變化）之后，神經(jīng)元的回聲響應(yīng)消失。除了2秒和4秒的時間間隔外，還測試了間隔為1秒，3秒，6秒和10秒的聲音刺激。發(fā)現(xiàn)間隔為3秒時，一連串的聲音刺激能引發(fā)出部分神經(jīng)元的回聲響應(yīng)，而間隔為1秒，6秒和10秒的聲音刺激這不能。另外，除了白噪音刺激外，還測試了純音刺激。發(fā)現(xiàn)所測試的不同聲強(qiáng)的所有純音都能引發(fā)回聲響應(yīng)，表明回聲響應(yīng)的發(fā)生不依賴于特定的聲音類型和聲強(qiáng)。并且，還分別測試了數(shù)目為5次，10次或30次的聲音刺激，發(fā)現(xiàn)聲音

10、刺激的數(shù)目至少要為10次才能引發(fā)回聲響應(yīng)?？傊?，在麻醉和清醒狀態(tài)下，初級聽覺皮層第2/3層神經(jīng)元都存在節(jié)律性聲音預(yù)測相關(guān)信號。
　　1.2.聽皮層第5層和第4層神經(jīng)元節(jié)律性聲音預(yù)測信號的檢測
　　為了實(shí)現(xiàn)對深層神經(jīng)元的清晰成像，通過僅在腦區(qū)深部注射鈣染料的方式來減少淺層神經(jīng)組織的熒光。鈣成像實(shí)驗(yàn)局限于初級聽覺皮層第5層神經(jīng)元，發(fā)現(xiàn)約33.5％的第5層神經(jīng)元在一連串間隔2秒的聲音刺激后表現(xiàn)出了回聲響應(yīng)。接著觀測了初級聽覺皮層第

11、4層共13個動物1934個神經(jīng)元，發(fā)現(xiàn)僅有約8％的神經(jīng)元在一串規(guī)律聲音刺激后表現(xiàn)出了回聲響應(yīng)。
　　2.聽皮層節(jié)律性聲音預(yù)測性信號的行為學(xué)表征
　　為了探索小鼠初級聽覺皮層預(yù)測信號的行為學(xué)表征，發(fā)展了一個簡單的聲音與舔水行為相偶聯(lián)的行為學(xué)任務(wù)。訓(xùn)練成功的小鼠會在每次聲音刺激（白噪音，76分貝，時長100毫秒）過后一段很短的時間內(nèi)進(jìn)行舔水行為。于是用一串間隔相同時間的白噪音刺激（間隔3秒或4秒，10次）來進(jìn)行行為學(xué)測試。發(fā)現(xiàn)在

12、聲音刺激結(jié)束后相應(yīng)的時間間隔點(diǎn)（3秒或4秒），所有小鼠都會再多舔水一次，出現(xiàn)了預(yù)測性舔水行為，即回聲舔水反應(yīng)。與初級聽覺皮層細(xì)胞水平上的回聲反應(yīng)相類似，五次連續(xù)的聲音刺激不能引發(fā)回聲舔水反應(yīng)。于是同步記錄了初級聽覺皮層的鈣信號和小鼠的舔水行為，同時作為對照，也同步記錄了尾側(cè)體感皮層的鈣信號。發(fā)現(xiàn)98％±1％的聲音本身引發(fā)的舔水行為和84％±7％的預(yù)測性回聲舔水行為與初級聽覺皮層的鈣信號相關(guān)。與之相對應(yīng)的是，初級聽覺皮層94％±4％的聲音

13、反應(yīng)和88％±2％的回聲反應(yīng)與小鼠對聲音本身的舔水反應(yīng)和預(yù)測性回聲舔水反應(yīng)相關(guān)。根據(jù)信號檢測理論分析，大約80％的回聲舔水反應(yīng)能夠被初級聽覺皮層的回聲反應(yīng)準(zhǔn)確預(yù)測。相反，尾側(cè)體感皮層的鈣信號與聲音引發(fā)的舔水行為和預(yù)測性舔水行為都沒有相關(guān)性。因此，小鼠的預(yù)測性回聲舔水行為與初級聽覺皮層預(yù)測信號高度相關(guān)。
　　3.聽皮層活動在節(jié)律性聲音預(yù)測性行為中的關(guān)鍵作用研究
　　3.1.光遺傳抑制初級聽覺皮層導(dǎo)致小鼠節(jié)律性聲音預(yù)測行為被抑制

14、
　　為了驗(yàn)證初級聽覺皮層的活動在產(chǎn)生預(yù)測性回聲舔水反應(yīng)中的必要性，進(jìn)行了兩種不同的光遺傳抑制實(shí)驗(yàn)。第一種方式是通過興奮光激發(fā)的外向質(zhì)子泵古紫質(zhì)（ArchT）將聽覺皮層的興奮性神經(jīng)元的活動進(jìn)行抑制。與對照組相比，抑制組小鼠的回聲舔水行為顯著減少，僅僅略高于自發(fā)舔水的發(fā)生率。第二種方式則是利用重組酶系統(tǒng)特異性的使得初級聽覺皮層內(nèi)小清蛋白陽性的抑制性神經(jīng)元表達(dá)二型離子通道視紫質(zhì)(ChR2)，進(jìn)而通過興奮這些小清蛋白陽性神經(jīng)元來達(dá)到抑制

15、初級聽覺皮層的活動。同樣，抑制組小鼠的回聲舔水行為顯著減少，幾近于自發(fā)舔水的發(fā)生率。因此，初級聽覺皮層的活動對于小鼠預(yù)測性回聲舔水反應(yīng)而言是必須的。
　　3.2.光遺傳興奮初級聽覺皮層可誘發(fā)小鼠的節(jié)律性聲音預(yù)測行為
　　接著測試了是否直接興奮初級聽覺皮層就能觸發(fā)小鼠的舔水行為。因?yàn)槌跫壜犛X皮層第5層是主要的輸出層，并且前面的實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了第5層神經(jīng)元存在回聲反應(yīng)。因此在第5層神經(jīng)元特異性表達(dá)二型離子通道視紫質(zhì)(ChR2)的轉(zhuǎn)基

16、因小鼠中進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。對于訓(xùn)練過的轉(zhuǎn)基因小鼠，用藍(lán)色激光雙側(cè)激活初級聽覺皮層第5層即可替代聲音刺激觸發(fā)小鼠的舔水行為，而對于未訓(xùn)練的轉(zhuǎn)基因小鼠或者訓(xùn)練過的野生型小鼠則都沒有效果。重要的是，在一串連續(xù)規(guī)律的藍(lán)色激光刺激后，訓(xùn)練過的轉(zhuǎn)基因小鼠出現(xiàn)了預(yù)測性回聲舔水行為。在部分小鼠中，同步刺激（第5層）并記錄初級聽覺皮層的活動，以及小鼠的舔水行為。發(fā)現(xiàn)由藍(lán)色激光刺激引起的舔水行為和預(yù)測性回聲舔水行為都與初級聽覺皮層的活動高度相關(guān)。另外，也測試了第

17、二種興奮聽覺皮層的光遺傳手段：注射興奮性光遺傳學(xué)病毒到初級聽覺皮層。同樣的，激光刺激引發(fā)的初級聽覺皮層興奮觸發(fā)了小鼠的舔水反應(yīng)和預(yù)測性回聲舔水反應(yīng)?？傊@些結(jié)果表明通過光遺傳的方式興奮一部分初級聽覺皮層的神經(jīng)元即可觸發(fā)小鼠的預(yù)測性回聲舔水反應(yīng)。
　　4.節(jié)律性聲音預(yù)測性行為不依賴于聽覺丘腦的活動
　　用光纖記錄群體細(xì)胞鈣信號的方式，在聽覺丘腦腹側(cè)和背側(cè)均記錄到穩(wěn)定的對聲音的反應(yīng)。而當(dāng)在一串間隔4秒的規(guī)律聲音刺激后，聽覺丘腦

18、的這兩個亞區(qū)都沒有顯示出回聲反應(yīng)。又進(jìn)一步用光遺傳抑制的方式在聲音刺激后八秒抑制了雙側(cè)聽覺丘腦的活動，發(fā)現(xiàn)對小鼠的回聲舔水行為的發(fā)生沒有顯著性影響。因此，我們的結(jié)果表明，聽覺丘腦的活動對于小鼠回聲舔水行為的產(chǎn)生不是必須的。
　　結(jié)論：
　　1.初級聽覺皮層第2/3，第4和第5層神經(jīng)元編碼節(jié)律性聲音預(yù)測信息;
　　2.初級聽覺皮層的節(jié)律性聲音預(yù)測信息是產(chǎn)生節(jié)律性聲音預(yù)測行為的關(guān)鍵;
　　3.聽覺丘腦對于節(jié)律性聲音預(yù)