大鼠初級(jí)聽皮層神經(jīng)元內(nèi)在電生理學(xué)特性和突觸傳遞功能的發(fā)育變化及聽覺剝奪的影響.pdf

1、視覺和軀體感覺的研究發(fā)現(xiàn)，早期的尤其是關(guān)鍵期內(nèi)的感覺經(jīng)驗(yàn)活動(dòng)對(duì)于丘腦皮層回路的發(fā)育必不可少，關(guān)鍵期后，神經(jīng)回路的重組很難再被誘導(dǎo)。N-甲基-D-天冬氨酸(N-mehyl-D-aspartate，NMDA)受體被公認(rèn)在中樞突觸發(fā)育過程中具有重要作用，NMDA受體介導(dǎo)的長時(shí)程增強(qiáng)(long-termpotentiation，LTP)可以誘導(dǎo)α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異唑丙酸(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-

2、isox-azolepropionicacid，AMPA)受體插入突觸后膜，使沉默突觸轉(zhuǎn)化為功能突觸，這是突觸可塑性變化的重要一步。盡管在視覺和軀體感覺系統(tǒng)中，谷氨酸突觸傳遞和經(jīng)驗(yàn)依賴可塑性的發(fā)育變化被深入研究，但對(duì)于其它感覺皮層突觸的成熟過程及其分子基礎(chǔ)還不清楚。 在體動(dòng)物研究表明：聽皮層在出生后經(jīng)歷了功能的成熟過程，出生后的前28天內(nèi)是大鼠聽皮層可塑性關(guān)鍵期，關(guān)鍵期內(nèi)的聽覺剝奪(auditorydeprivation，AD)

3、會(huì)導(dǎo)致聽皮層音頻構(gòu)筑難以形成，然而，相對(duì)于視覺和軀體感覺的類似研究，在突觸回路水平對(duì)聽皮層成熟過程進(jìn)行的研究很少。初級(jí)聽皮層(primaryauditorycortex，AⅠ)3/4層神經(jīng)元是接受聽覺傳入的主要區(qū)域，聽覺信息在AⅠ3/4層神經(jīng)元的整合是聽覺識(shí)別和感知的關(guān)鍵步驟。神經(jīng)元的內(nèi)在膜特性及其與其它神經(jīng)元之間的突觸聯(lián)系則是決定信息整合方式的兩個(gè)重要因素，另外，神經(jīng)元形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)是功能的基礎(chǔ)，樹突大小可以影響神經(jīng)元的電緊張?zhí)匦院蛡魅胪?/p>

4、觸的數(shù)量，在信息整合、突觸可塑性及回路聯(lián)系構(gòu)建中具有重要作用。 本研究的主要目的之一是觀察發(fā)育過程中AⅠ3/4層內(nèi)神經(jīng)元內(nèi)在膜特性、興奮性突觸傳遞功能以及形態(tài)學(xué)特征的變化。選擇1～28天齡的大鼠，制備聽皮層腦片，采用膜片鉗全細(xì)胞記錄，觀察AⅠ3/4層神經(jīng)元靜息膜電位(restingmembranepotential，RMP)、輸入阻抗(inputresistance，Ri)、時(shí)間常數(shù)(timeconstant，Tau)和動(dòng)作電位

5、(actionpotential，AP)等內(nèi)在膜特性指標(biāo)；刺激傳入纖維，記錄突觸后電流，灌流液內(nèi)加入γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyricacid，GABBA)受體拮抗劑荷包牡丹堿(bicucullinemethiodide，BMI)、AMPA受體拮抗劑6-氰基-7-硝基喹啉-二酮(6-cyano-7-nitroquinoxaline-2，3-dione，CNQX)和NMDA受體拮抗劑D,L-2-氨基-5-磷酸基戊酸(D，L

6、-2-amino-5-phosphonovalericacid，AP5)以分離興奮性突觸后電流(excitatorypostsynapticcurrents，EPSCs)成分，分析NMDA受體介導(dǎo)的EPSCs(NMDA-EPSCs)在總的由谷氨酸受體介導(dǎo)的EPSCs(total-EPSCs)中的比率變化以及其動(dòng)力學(xué)的改變；采用配對(duì)刺激實(shí)驗(yàn)對(duì)AⅠ3/4層內(nèi)傳入突觸的突觸前特性進(jìn)行研究；電生理記錄的同時(shí)向細(xì)胞內(nèi)注入生物胞素(biocytin

7、)，進(jìn)行免疫組化染色觀察神經(jīng)元形態(tài)學(xué)特征。為研究聽覺經(jīng)驗(yàn)對(duì)聽皮層功能發(fā)育的影響，在出生后4～6天，損毀雙側(cè)耳蝸，制備AD模型，觀察AD對(duì)AⅠ神經(jīng)元電生理學(xué)和形態(tài)學(xué)特性的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下： 1、AⅠ3/4層神經(jīng)元膜特性的發(fā)育變化及AD的影響 在出生后的第一周，大鼠AⅠ3/4層神經(jīng)元具有較高的RMP(-50.5mV)、Ri(613.1MΩ)和Tau(30.0ms)，隨著天齡增加，RMP、Ri、Tau逐漸降低，至出生后第三周

8、基本穩(wěn)定；大鼠AⅠ3/4層神經(jīng)元AP波形在出生的前三周內(nèi)迅速成熟，表現(xiàn)為幅度增加、持續(xù)時(shí)間縮短，誘發(fā)大鼠AⅠ3/4層神經(jīng)元AP發(fā)放的閾電流逐漸增大。AD后，AⅠ3/4層神經(jīng)元RMP、Ri、Tau高于正常，誘發(fā)AP的閾電流水平降低。這些結(jié)果提示大鼠AⅠ3/4層神經(jīng)元的膜特性在出生后的前三周迅速成熟，其中被動(dòng)膜特性的成熟依賴于聽覺經(jīng)驗(yàn)；AD后AⅠ3/4層神經(jīng)元興奮性增加。 2、AⅠ3/4層神經(jīng)元興奮性突觸傳遞功能的發(fā)育變化

9、大鼠AⅠ3/4層神經(jīng)元內(nèi)的興奮性突觸傳遞由AMPA和NMDA受體介導(dǎo)，兩者分別介導(dǎo)了EPSCs中的快、慢兩種成分。在出生后四周內(nèi)，NMDA/total-EPSCs的比率從0.74(P5-7)逐漸降低至0.44(P26-28)，AMPA/NMDA-EPSCs比率從P5-7的0.37逐漸增加到P26-28的1.43，大鼠AⅠ3/4層內(nèi)NMDA電流的上升和下降時(shí)間隨周齡增加而逐漸縮短，NMDA亞基NR2A的表達(dá)則隨發(fā)育過程逐漸增加。對(duì)突觸前特

10、性的研究表明：在發(fā)育早期，大鼠AⅠ3/4層神經(jīng)元內(nèi)的興奮性突觸傳遞對(duì)配對(duì)刺激主要表現(xiàn)為配對(duì)脈沖抑制(paired-pulsedepression，PPD)，隨發(fā)育過程，配對(duì)脈沖比率(paired-pulseratio，PPR)逐漸增加，在較成熟大鼠內(nèi)，配對(duì)刺激反應(yīng)主要表現(xiàn)為配對(duì)脈沖易化(paired-pulsefacilitation，PPF)。本部分的研究表明：AⅠ3/4層神經(jīng)元興奮性突觸傳遞功能在出生后的四周內(nèi)經(jīng)歷了成熟的過程，涉及

11、突觸前遞質(zhì)釋放概率的降低以及突觸后NMDA-EPSCs成分和動(dòng)力學(xué)的變化，NMDA受體亞單位NR2A表達(dá)的發(fā)育性增加可能是NMDA-EPSCs變化的分子基礎(chǔ)。 3、AD影響AⅠ3/4層神經(jīng)元興奮性突觸傳遞功能的發(fā)育 發(fā)育早期的AD顯著延遲了AⅠ3/4層神經(jīng)元興奮性突觸傳遞功能的發(fā)育變化。與正常聽力動(dòng)物相比，AD大鼠AⅠ3/4層神經(jīng)元興奮性突觸傳遞中NMDA受體介導(dǎo)的成分增加；NMDA-EPSCs的下降時(shí)間延長；NR2A陽

12、性神經(jīng)元的密度降低；PPR降低。本部分的研究表明：AⅠ3/4層神經(jīng)元興奮性突觸傳遞中，突觸前和突觸后特性的成熟依賴于聽覺經(jīng)驗(yàn)，AD能夠延遲AⅠ3/4層神經(jīng)元興奮性突觸傳遞功能的成熟過程。 4、大鼠發(fā)育過程中AⅠ神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)特性及AD的影響 隨著出生后天齡的增加，AⅠ神經(jīng)元胞體逐漸增大，而細(xì)胞密度則逐漸下降，至P28后達(dá)到成年水平。采用biocytin細(xì)胞內(nèi)染色技術(shù)，對(duì)來自1～28天齡大鼠的72例神經(jīng)元進(jìn)行了成功標(biāo)記，其

13、中正常組45例，AD組27例。AⅠ3/4層神經(jīng)元粗大的頂樹突伸向皮層表面，軸突較細(xì)，向顆粒下層投射，終末形成終扣。隨天齡增加，樹突野擴(kuò)大，神經(jīng)元樹突總長度從P5-7到P19-21升高了3倍。和正常聽力動(dòng)物相比，AD大鼠AⅠ3/4層內(nèi)神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)特征未見顯著改變。以上結(jié)果表明：大鼠AⅠ3/4層內(nèi)神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)特性在剛出生時(shí)尚未發(fā)育成熟，至出生后第4周才達(dá)到成熟，這一過程不依賴于聽覺經(jīng)驗(yàn)。 5、AⅠ3/4層內(nèi)存在電突觸聯(lián)系