p38-MAPK-AQP1調(diào)控細(xì)胞遷移在HPS肺血管重建中的機制研究.pdf

1、背景和目的：
　　肝肺綜合征(hepatopulmonary syndrome，HPS)是一種綜合病征，主要表現(xiàn)為:肝?。ㄔl(fā)）-肺內(nèi)微血管擴張(intrapulmonary microvascular dilatation，IPVD)-低氧血癥，在肝硬化患者中發(fā)病率可達(dá)4-47％。HPS晚期常常伴肺動脈高壓，這是各類肝臟疾病患者圍術(shù)期肺部并發(fā)癥的主要原因之一，也是引起圍術(shù)期移植肝無功能的關(guān)鍵原因。目前已經(jīng)證實IPVD是HPS進(jìn)程

2、中的早期核心變化，而肺血管重建(pulmonary vascular remodeling，PVR)也是HPS的主要病理機制之一。
　　我們采用經(jīng)典膽總管結(jié)扎大鼠(common bile duct ligation，CBDL)模型，發(fā)現(xiàn)了一個有趣現(xiàn)象:正常大鼠的肺微血管管壁是由一層內(nèi)皮細(xì)胞有序排列而成，而HPS大鼠的肺微血管管壁異常增厚。在顯微鏡下取增厚的血管壁，進(jìn)行原代培養(yǎng)和鑒定，里面有部分細(xì)胞CD34、Ⅷ因子相關(guān)抗原檢測陽性(

3、+);部分細(xì)胞α-SM-actin染色檢測陽性(+)，提示組成增厚血管壁的“平滑肌樣”細(xì)胞可能來自于原位的PMVECs肌樣分化或異位的PASMCs;這些出現(xiàn)在內(nèi)膜的“平滑肌樣”細(xì)胞較難用單純PMVECs肌樣分化解釋。細(xì)胞遷移（cell migration）是一個復(fù)雜的過程，可以被多條信號通路調(diào)節(jié)，參與血管新生、血管重塑、腫瘤轉(zhuǎn)移、傷口愈合等。其次，細(xì)胞遷移與細(xì)胞膜上水通道蛋白(aquporin1，AQP1)的表達(dá)密切相關(guān)，AQP1的異常

4、表達(dá)與分布常常伴隨著細(xì)胞異常遷移。p38-MAPK是絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)家族成員之一，可以被不同的胞外刺激所激活，也是細(xì)胞遷移所需的一個關(guān)鍵因子。因此，本研究探討了HPS病理進(jìn)程中是否存在p38-MAPK/AQP1通路異常，引起細(xì)胞遷移參與了PVR過程。
　　我們在拓展研究中發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞極性丟失將導(dǎo)致無節(jié)制的細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移，其中，細(xì)胞極性丟失可能是HPS肺血管重建的上游關(guān)鍵事件。
　　方法:
　　實驗分五

5、部分
　　1.構(gòu)建CBDL大鼠模型
　　采用CBDL構(gòu)建HPS大鼠模型，行病理切片及血氣分析(4w)，制備血清。
　　2.PASMCs的原代培養(yǎng)及細(xì)胞遷移的檢測
　　正常SD大鼠（7w齡，160-200g），取肺動脈主干及左右肺動脈組織行原代培養(yǎng)、純化及鑒定PASMCs。隨機分為2組:對照組（sham組）和CBDL實驗組(CBDL組)，采用transwell檢測和劃痕實驗，分別于培養(yǎng)24h、48h和72h(T1、

6、T2、T3)時，鏡下觀察細(xì)胞遷移情況。
　　3.AQP1參與了CBDL大鼠血清誘導(dǎo)的PASMCs細(xì)胞遷移的檢測
　　在T1、T2、T3時相點，運用RT-PCR和western blot法分別檢測sham組和CBDL組PASMCs中AQP1mRNA及蛋白表達(dá)，免疫組化對大鼠肺血管中AQP1表達(dá)定位，及免疫熒光對體外培養(yǎng)的PASMCs中AQP1表達(dá)檢測。siRNA干擾AQP1表達(dá)后，transwell檢測細(xì)胞遷移改變。
　

7、　4.p38-MAPK參與了CBDL大鼠血清誘導(dǎo)的PASMCs AQP1依賴性細(xì)胞遷移的檢測
　　下調(diào)PASMCs中p38-MAPK活性，western blot法檢測PASMCs中AQP1表達(dá)及transwell檢測細(xì)胞遷移能力。
　　5.細(xì)胞極性丟失參與調(diào)控HPS肺血管重建的檢測（拓展研究部分）
　　免疫熒光檢測sham組和CBDL組大鼠肺血管內(nèi)膜細(xì)胞極性蛋白定位改變，pull-down檢測cdc42蛋白活性及F-

8、actin染色檢測細(xì)胞骨架重塑，采用transwell小室和Ki67染色檢測細(xì)胞極性丟失后細(xì)胞增殖遷移情況。
　　結(jié)果:
　　1.CBDL大鼠血清對PASMCs細(xì)胞遷移的影響
　　1)在倒置顯微鏡下觀察:細(xì)胞呈長梭形、三角形，交織成網(wǎng)狀，胞核清晰，胞漿豐富。
　　2)與sham組比較，CBDL組PASMCs細(xì)胞遷移增加(P＜0.05)，且呈時間依賴性。
　　2.AQP1參與調(diào)控PASMCs細(xì)胞遷移
　

9、　1)與sham組比較，CBDL組PASMCs內(nèi)AQP1mRNA及其蛋白表達(dá)增加(P＜0.05)，且呈時間依賴性;與sham組比較，CBDL組PASMCs中AQP1綠色熒光表達(dá)增強。
　　2)在sham組和CBDL組中，與siCtrl組比較，siAQP1組PASMCs細(xì)胞遷移數(shù)目減少(P＜0.05)，且在CBDL組中，呈時間依賴性。
　　3.p38-MAPK參與調(diào)控PASMCs的AQP1依賴性細(xì)胞遷移
　　1)與sha

10、m組比較，CBDL組PASMCs內(nèi)p38-MAPK蛋白表達(dá)增加(P＜0.05）;
　　2)與CBDL組比較，CBDL+SB203580(1、5uM)組p38-MAPK、AQP1蛋白表達(dá)減少（P＜0.05），且呈劑量依賴性(0、1、5uM);并且SB203580可以有效抑制AQP1介導(dǎo)的細(xì)胞遷移(P＜0.05)。
　　4.細(xì)胞極性丟失參與調(diào)控HPS肺血管重建（拓展研究部分）
　　1)肺組織免疫熒光結(jié)果顯示，在sham組，

11、細(xì)胞極性蛋白podocalyxin(PCX)主要分布于血管內(nèi)膜細(xì)胞的頂端，而β-catenin分布于底-側(cè)端;而在CBDL組，細(xì)胞極性蛋白podocalyxin和β-catenin在血管內(nèi)膜細(xì)胞發(fā)生了異位，錯亂分布于細(xì)胞周圍。
　　2)在體外CBDL血清培養(yǎng)的PMVECs，與sham組比較，CBDL組cdc42活性表達(dá)增加(P＜0.05);與CBDL組比較，CBDL+casin組可以有效抑制cdc42活性表達(dá)(P＜0.05)。

12、r>　　3)與sham組比較，CBDL組PMVECs細(xì)胞骨架F-actin發(fā)生重塑，而CBDL+casin組排列紊亂的骨架恢復(fù)正常;與sham組比較，CBDL組PMVECs細(xì)胞遷移、增殖增加(P＜0.05)，而在CBDL+casin組細(xì)胞遷移、增殖受到抑制(P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　1.CBDL大鼠血清可促進(jìn)PASMCs發(fā)生細(xì)胞遷移。
　　2.CBDL大鼠血清誘導(dǎo)PASMCs內(nèi)AQP1mRNA及其蛋白表達(dá)增強，

13、干擾AQP1蛋白表達(dá)可以明顯抑制PASMCs的細(xì)胞遷移，提示CBDL大鼠血清通過AQP1促進(jìn)PASMCs細(xì)胞遷移。
　　3.CBDL大鼠血清誘導(dǎo)PASMCs內(nèi)p38-MAPK蛋白活性增強，干擾p38-MAPK蛋白活性可以明顯抑制AQP1的蛋白表達(dá)及細(xì)胞遷移，提示p38-MAPK信號通路參與了PASMCs的AQP1依賴性細(xì)胞遷移，在HPS的發(fā)生發(fā)展過程起著重要作用。
　　4.CBDL大鼠肺組織血管內(nèi)膜細(xì)胞極性蛋白發(fā)生異位;在體